Une procédure de 1,5 heure pour l'identification des Enterococcus Espèces directement à partir d'hémocultures

1. Prélèvement et préparation Recueillir le sang veineux de patients soupçonnés d'infection et mis dans deux BACTEC (BD, Sparks, MD) flacons d'hémoculture, une aérobie et anaérobie une, ensemble comprenant un ensemble d'hémoculture. Placez les bouteilles dans le BACTEC 9240 l'instrument à 35 ° C. Incuber tant que l'instrument est déclenchée une alarme en raison de la croissance des organismes dans le flacon d'hémoculture. Enlever la bouteille de l'instrument de la culture du sang. 2. Préparation des réactifs avant la coloration Préparer la solution de lavage en ajoutant 4 ml de solution de lavage 60x suivi par 240 ml d'eau déminéralisée ou distillée frais directement à l'antenne de coloration. Mettez le plat dans la coloration de 55 ° C à bain d'eau tiède. Stocker le concentré restant à 2-8 ° C. Enlever le milieu de montage du réfrigérateur et à température ambiante. 3. La coloration de Gram Remuer doucement le flacon d'hémoculture. En utilisant une aiguille et la seringue ou d'un appareil de repiquage, enlever le sang (environ 5 ml) de la bouteille et placer dans un tube à vis stériles plafonné. En utilisant une pipette stérile, déposer une goutte de sang sur un grand une lame de microscope en verre. L'air sec de la lame et fixer au méthanol pendant 10 secondes. Laisser sécher à l'air glisser. Effectuer une coloration de Gram sur le film de sang pour déterminer la morphologie de l'organisme en croissance dans le flacon d'hémoculture. En utilisant un objectif à immersion d'huile, affichage des diapositives. Cocci à Gram positif en paires et de courtes chaînes observées sur la coloration de Gram est la plus compatible avec les espèces Enterococcus. Ce résultat Gram entraîne alors le choix de la trousse appropriée ANP sonde FISH à utiliser pour l'identification bactérienne. Cette culture de sang seront colorées à l'aide de la E. faecalis / OE PNA FISH tache. 4. PNA FISH Stain Mélanger le tube contenant le sang doucement en remuant avant la préparation du frottis. Déposer une goutte de solution de fixation sur le bien d'une diapositive ANP Microscope FISH. Transfert 10 uL ou une petite goutte du tube avec l'hémoculture positive à la solution de fixation et mélanger délicatement pour émulsionner. Fixer le frottis en les chauffant pendant 20 min. à 55 ° C sur une plaque chauffante. 5. Matériel de contrôle de qualité Une positive et négative d'une diapositive de contrôle de qualité doivent être testés avec chaque lot de lames pour la coloration. Utilisez E. faecalis / OE contrôle Diapositives acheté AdvanDx à cet effet ou préparer des frottis de cultures liquides des souches de référence de E. faecalis et E. faecium de contrôle positif, soit sur ​​des lames séparées ou mélangées sur une lame et Staphylococcus spp ou Streptococcus spp comme matériau de contrôle négatif. Les résultats du CQ devraient être capables de surveiller les conditions d'essai appropriées, en particulier ceux qui affectent la rigueur d'hybridation et la pénétration de la paroi cellulaire, puisque la méthodologie PNA est conçu pour optimiser la pénétration des parois cellulaires 6. Hybridation Ajouter une goutte de E. faecalis / OE PNA pour le bien sur la lame de microscope avec le frottis. Ajouter lamelle. Eviter les bulles d'air. Incuber pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C sur plaque chauffante Après une incubation lieu les diapositives dans le support glisser 7. Lavez strictes Porteuse glisser Plongez dans la solution de lavage préchauffé à 55 ° C et retirer délicatement la lamelle. Souvent, la lamelle glisse par les agitant doucement la lame dans la solution de lavage. Occasionnellement, la lamelle doit être doucement poussés hors avec une pince. Incuber dans la solution de lavage pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C. Retirez les diapositives de la solution de lavage Laisser la lame sécher à l'air 8. Montage Ajouter une goutte de milieu de montage à chaque diapositive Ajouter lamelle. Eviter les bulles d'air. Examiner la lame sur un microscope à fluorescence dans les 2 heures. Ne pas exposer les diapositives à la lumière directe du soleil ou d'autres sources de lumière forte, car cela pourrait conduire à l'extinction de fluorescence. 9. Interprétation des résultats Le microscope à fluorescence utilisé pour l'examen diapositive doit être équipé du filtre Dual Band AdvanDx et un objectif 60x ou 100x huile. Les diapositives doivent être examinées QC premier à confirmer que l'hybridation ne se produisent. E. faecalis doit apparaître comme un vert brillant fluorescent cocci dans de multiples domaines de vue et les E. faecium apparaîtra comme un rouge vif cocci. Lame de contrôle non-entérocoques devrait apparaître non fluorescent. Après avoir vérifié le système de contrôle, les diapositives des patients peuvent être examinés. Au début, le fil de sangm apparaîtra rouge mais le rouge vif et vert cocci sera tout à fait évident. Des exemples représentatifs Figure 1. De vert-positif E. faecalis (à gauche), positif rouge E. faecium (au milieu), et les résultats des tests négatifs (à droite). 10. Les résultats représentatifs Trois institutions ont été inclus dans un essai clinique multicentrique évaluant ce PNA FISH taches et comparant un protocole 2,5 heures à l'heure raccourcie 1.5 du protocole qui vient d'être examiné. Un total de 152 cocci à Gram positif en paires de routine et des chaînes (GPC) flacons d'hémoculture positifs ont été inclus dans les études. Il était de 100% (152/152) accord entre les résultats de l'modifiée et la procédure de dosage original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 et 78/78 autres entérocoques GPC d'autres (tableau 1). Cette méthode de coloration a une sensibilité exquise et une spécificité au cours de cet essai clinique (tableau 2). Méthodes de routine E. faecalis / OE procédure standard ANP POISSONS E. faecalis / OE procédure ANP POISSONS court E. faecalis 41 41 (Vert Positif) 41 (Vert Positif) E. faecium 27 27 (Rouge Positif) 27 (Rouge Positif) E. casseliflavus 2 2 (Rouge Positif) 2 (Rouge Positif) E. gallinarum 2 2 (Rouge Positif) 2 (Rouge Positif) Autres Enterococcus spp. 2 2 (Rouge Positif) 2 (Rouge Positif) S. pneumoniae 17 17 (négatif) 17 (négatif) S. viridans 33 33 (négatif) 33 (négatif) S. mitis 1 1 (négatif) 1 (négatif) S. pyogenes 3 3 (négatif) 3 (négatif) S. bovis 2 2 (négatif) 2 (négatif) S. salivarius 1 1 (négatif) 1 (négatif) S. sanguinis 2 2 (négatif) 2 (négatif) S. agalagtae 7 7 (négatif) 7 (négatif) Autres Streptococcus spp. 7 7 (négatif) 7 (négatif) Abiotrophia spp. 3 3 (négatif) 3 (négatif) Peptostrepococcus spp. 2 2 (négatif) 2 (négatif) Total des 152 152/152 100% Accord 152/152 100% Accord Listing Tableau 1. De bactéries testées en utilisant à la fois la norme (2.5hr) et rapide (1,5 h) protocole. Sensibilité E.faecalis Sensibilité autres Enterococcus spp. La spécificité 100% (41/41) 95% (de 93,0 à 100) CI 100% (33/33) 33/33 95% (de 91,3 à 100) CI 100% (78/78) 95% (de 96,2 à 100) CI Tableau 2. Sensibilité et spécificité du protocole de PNA FISH 1,5 heures.