Мио-механический анализ изолированных скелетных мышц

Протокола осуществляется с одобрения UCSF Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC). 1. Препарирование Мышь Экстензорных пальцев Лонга (ДЭС) мышц Выполнение всех животных процедур в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Усыпить животное с 200 мг / кг внутрибрюшинно пентобарбитал / шейки дислокации незадолго до мышц урожая 10. Рассечение должны быть отработаны так, что мышцы могут быть собраны и установлены в преобразователь напряжения в течение 15 минут эвтаназии. Упорядочить тушу на спине на лоток рассечение и пин-код ногу в трей. Под микроскопом вскрытия, открытый коже, осторожно откройте фасции (рис. 1а), а кожуру большеберцовой от лодыжки вверх, чтобы разоблачить EDL (рис.1б). Использование капель раствора лактата Рингера держать мышцы влажные и буфером во время сбора урожая. Удалить EDL, сохраняя столько сухожилия насколько возможно на каждом конце, и положить в чашку Петри с раствором лактата Рингера. Tie шва к каждому из мышц сухожилий (Fig.1C). Очень важно, чтобы мышечные волокна не коснулась или нарушения во время вскрытия. 2. Монтаж Мышь EDL в Myograph Газа мышц Для этих исследований тканей ванны необходимы, что обеспечивает мускула, что позволяет ему купаться в физиологическом растворе при постоянной температуре с непрерывной оксигенации. Ванна в сочетании с силой датчик для измерения напряжения мышц. У нас работают интегрированные мышц полосы myograph ванны из датских Мио технологий (DMT Модель 820MS) для этой цели. Кроме того, прямоугольные импульсы электрического стимулятора (Grass Модель S48) и сбора данных платформы (ADInstruments PowerLab Data System Приобретение и LabChart программное обеспечение), необходимые для выявления, учета и анализа мио-механические ответы, соответственно. 820MS DMT имеет платиновыми электродами интегрированы в крышку камеры, которые расположены по обе стороны от мышц, в средней части мышцы полосы. Другие myographs может потребовать особого внимания к электроду размещения. Заполните myograph ванну с 5 мл Кребса Хенселейта 11. Нагреть до 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) через ванну в течение 15 минут перед использованием. Используйте швы, чтобы продлить EDL между зажимами myograph и безопасной сухожилия EDL мышцы (Fig.1D, E) между зажимами. Будьте осторожны, чтобы не зажимать мышцы. Поддерживать myograph бане при 25 ° C. 3. Мио-механический анализ А. Twitch напряженности Установить начальную длину в ванне, так что нет мышц расхлябанности. Определите максимальный стимул (длительностью 0,5 мс), регулируя напряжение с целью получения максимальной напряженности дергаться, то набор стимулов на 20% выше максимальной (для достижения supramaximal стимула). В наших исследованиях supramaximal стимул, как правило, достигается при выходе 40 вольт. Проверьте выход из стимулятор с помощью осциллографа. Определить оптимальную длину постепенно растяжение мышц, пока не будет дальнейшего увеличения дергаться напряженности. Разрешить мышцы, чтобы уравновесить в течение 3 мин. Доставить supramaximal квадратных стимула (0,5 мс) при оптимальной длине использованием Трава S44 электронного стимулятора, и записать вывод. Запись: дергаться напряженности кривой (Р и в зависимости от времени; рис. 2). Б. Столбняк напряженности Разрешить мышц, чтобы отдохнуть в течение 3 минут. Применить поезд supramaximal стимулы для 300msec при 150 Гц при оптимальной длине использованием Трава S44 электронного стимулятора, и записать вывод. Запись: столбняка напряженности кривой (Р о зависимости от времени; рис.2б). С. Силы частоты Разрешить мышц, чтобы отдохнуть в течение 3 минут. Силы частота: применять поездов supramaximal стимулов на 30, 60, 100, 140 и 160 Гц с 3 минут отдыха между стимулом (рис.3). Кроме того, поезда могут быть применены 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 и 160 Гц для лучшего разрешения на более низких частотах, где силы существенно изменяется. Сюжет: форс-частоты отношения (% максимальной силы против стимуляции частота). Д. Усталость Применить последовательность коротких столбняка: 60 ​​Гц в течение 300 мс (или частота регулируется для получения 50% от пиковой силы), каждые 3 секунды в течение 10 минут. К 10 минут, тетаническое сила должна отказаться от плато уровне ~ 15% от начального значения (рис.4). Участок: низкая утомляемость частоты (% максимальное время против силы). Е. Дополнительные сбора данных в конце протокола Перед размонтирования мышцы от myograph, установить MUSCле при оптимальной длине, как это определено в пункте III.A.4 и измерить его диаметр с использованием либо глазных на микроскопом или с суппортами. Вычислить площадь поперечного сечения (мкм 2). Мера мышечную массу (мг) путем удаления швов и весом мышцы. Взвесьте мыши для оценки массы тела (г). 4. Расчеты Мышцы: отношение массы тела = мышечная масса / масса тела Twitch напряжение, Р Т (Мп) = максимального напряжения, образующихся при дергаться Конкретные напряженности дергаться (Н / см 2) = дергаться напряжения (MN) / площадь поперечного сечения (мкм 2) х 10 5 Н / мН • мкм 2 / см 2 Время до пика напряжения (мс) = время от начала сокращения до максимального напряжения Half-время релаксации (мс) = время от пика напряжения до 50% от пикового напряжения Тетаническое напряжение, Р О (тп) = максимального напряжения, образующихся при столбняка Конкретные тетаническое натяжения (Н / см 2) = тетаническое натяжение (мН) / площадь поперечного сечения (мкм 2) х 10 5 Н / мН • мкм 2 / см 2 Максимальная скорость нарастания столбняка (N / с) = Максимальная скорость роста напряженности во время роста напряженности столбняка, т.е. максимального наклона кривой тетаническое напряжения (или, дР O / д) Half-релаксации тетаническое напряжения (мс) = время от прекращения стимуляции до 50% от напряжения на прекращение стимуляции Twitch напряжение до тетаническое соотношение напряжения, P T / P = O максимальное напряжение дергаться / максимальная напряженность тетаническое Усталость индекс = коэффициент напряженности через две минуты низкой усталостью частоту максимального изометрического напряжения 5. Представитель Результаты Рисунок 1. Препарирование EDL мышцы. , Выдержки из задних конечностей muscles.TA, передней большеберцовой. B, выдержки из EDL (разгибателей пальцев Лонга) мышцы. C, Приложение швов на EDL сухожилия. D, напряжение преобразователя ванна (вид со стороны). Е, EDL установлен в ванной (вид сверху). Мышцы полностью погружен в буфер в иллюстративных целях, на практике, мышцы должны быть полностью погружены, чтобы предотвратить от высыхания. Рисунок 2. Пример напряженности кривых. , Пример дергаться напряженности кривой иллюстрирующий максимальное напряжение дергаться (р т), сокращение времени (КТ) и половину времени релаксации (ЗГТ). Бар, 1 с. B, Пример тетаническое кривой напряжения показывает максимальное тетаническое напряжения (Р о) и половину релаксации тетаническое натяжения (HRTT). Бар, 1 с. Рисунок 3. Пример форс-частоты отношения анализа. , Напряженность порожденных дополнительные частоты стимуляции. B, Пример импульсов на 30 МГц. Бар, 80 мс. C, Пример импульсов на 140 МГц. Бар, 80 мс. D, пример силы частоты кривая получена на основе данных показано на. Форма форс-частотной кривой характерна мышечная сила, и их можно сравнить между мышцами различных животных. Рисунок 4. Пример анализа низких частот усталость. , Декрементные напряженностью свыше период низких stimulation.Examples частота импульсов в указанных точках времени (B, C, D), приведены ниже. E, пример низкой кривой усталости частоты на основе данных показано на. Форма кривой усталости низкие частоты характерна мышечная сила, и их можно сравнить между мышцами различных животных.