Dissection d'un oeil de la souris pour un mont entiers de l'épithélium pigmentaire rétinien
Summary
Une démonstration formelle de la dissection d'un oeil de la souris, résultant en une monture ensemble de l'épithélium pigmentaire rétinien.
Abstract
L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) se trouve à l'arrière de l'œil chez les mammifères, juste sous la rétine neurale, qui contient les photorécepteurs (cônes et bâtonnets). L'EPR est une monocouche de cellules cubiques pigmentaires et associés étroitement avec la rétine neurale juste au dessus. Cette association fait l'EPR de grand intérêt pour les chercheurs qui étudient les maladies rétiniennes. L'EPR est aussi le site d'un essai in vivo d'homologie dirigée réparation de l'ADN, le test p ONU. L'oeil de la souris est particulièrement difficile de disséquer en raison de sa petite taille (environ 3,5 mm de diamètre) et sa forme sphérique. Cet article montre en détail une procédure pour la dissection de l'œil entraînant une monture ensemble de l'EPR. Dans cette procédure, nous montrons comment travailler avec, plutôt que contre, la structure sphérique de l'œil. En bref, le tissu conjonctif, des muscles et du nerf optique sont retirés du fond de l'œil. Ensuite, la cornée et le cristallin sont supprimés. Ensuite, coupures stratégiques sont prises qui aboutissent à un aplatissement significatif du tissu restant. Enfin, la rétine neurale est délicatement soulevé, révélant une RPE intacte, ce qui est encore attaché à la choroïde sous-jacente et la sclère. Ce support entière peut être utilisé pour effectuer le test p ONU ou de l'évaluation immunohistochimie ou immunofluorescence du tissu EPR.
Protocol
Discussion
L'EPR est le site de l'essai p de l'ONU, un essai in vivo d'homologie dirigée réparation. Le dosage de l'ONU p a été utilisé pour étudier les effets des dommages d'ADN différentes 1,2 et de signalisation des dommages de l'ADN et les gènes de réparation 3,4,5 sur la fréquence d'homologie dirigée réparation. Ce test est très sensible, en détectant une seule cellule événements sur l'EPR 1. I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Institut national des sciences de la santé environnementale [K22ES012264 d'AJRB] et une American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-GRI-00-173-04] pilotes projectaward [à AJRB]. Nous remercions également les membres du laboratoire de l'évêque pour la lecture critique du manuscrit et des commentaires sur la vidéo et Adam Brown, en particulier, pour l'exemple de quoi ne pas faire. Nous remercions le Dr Donald McEwen, de l'Institut Greehey enfants recherche sur le cancer pour nous avoir permis l'utilisation de son champ de dissection / vidéo de la caméra set-up pour le tournage de la vidéo de dissection. Nous remercions Daron Brown à Corte Instruments pour l'affûtage et la réparation de nos outils de microdissection.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| straight forceps | Roboz | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX | |
| 45° forceps | Roboz | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX | |
| 15° “up” forceps | Roboz | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX | |
| spring scissors | Roboz | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel | |
| binocular dissecting microscope | Ziess | Discovery V.8 | use reflected light source | |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
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