のために人間のルシフェラーゼ-タグ付き悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の同所Xenografting in vivoでテスト

1。非ヌード免疫不全マウス（ヌード系統に必要ではない）の初期の準備： すべての手順は、レビューおよび承認を事前にUAB動物実験用の委員会によって、適切に訓練された人材によって実施された。我々はこれらの実験のための免疫不全マウスの3系統を正常に使用している：）フォックスチェースは、SCIDマウスを交系（CB17/lcr- Prkdc SCID / lcrCrlマウス）と、b）NIH IIIマウス（NIHS – Lyst BG Foxn1 NU BRK XIDマウス ）、およびc ）NOD -SCIDγマウス（NOD.Cg – Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJマウス）。私たちの手では、同所性異種移植片の成長は、T細胞、B細胞とNK細胞の機能に影響を与える変異を運ぶどちらもNIH IIIとNOD -SCIDγマウス、で事実上同一であり、このプロトコルのため、日数は、移植に必要な成長は、治療を開始し、イメージングの実行時に時間が後の移植される時刻は、我々は経験的にNOD -SCIDγのマウスを用いて決定したものです。フォックスチェースの移植片の成長は、T -およびB -細胞機能の欠陥を持っているSCIDマウスを、非近交系、通常は時間がかかります。 非ヌード免疫不全マウスの多数のグラフト容易にするために、我々は前に移植に午後に手術部位から毛を取り除く。マウスは、廃ガスのスカベンジで気化器に接続されたイソフルラン誘導のチャンバーを使用して麻酔する。体温を維持するために、動物はこのプロセスを通して加熱パッドで処理されます。クリッパーズは、接木される側の後肢の膝に半ば後ろから髪を除去するために使用されています。任意の残りの毛は、慎重に化学脱毛剤を使用して〜5分の場所（例えばNairさん、敏感肌のためのアロエベラを持つ特定の製品の）から削除されます。それは皮膚、眼、そしてそれが広がる可能性に他の体表面の刺激となることが脱毛の製品の除去をお勧めします。我々は移植しないとこのように、これらの実験で、両方の坐骨神経は、二国間の研究グループからのマウスの損失が発生、hindleg機能が損なわれる可能性があります。 マウスは完全に寝具なしで隔離ケージ内の加熱パッド上に回復するために許可されていますが、これは両方のマウスが他の、より完全に警告の動物でけがをされていないことを保証し、誤って寝具を吸い込むことを防ぎます。マウスは完全に携帯電話であり、フラフラの状態の証拠を見せないと、それらは他のマウスとケージに再導入することができます。 2。グラフトの日に注射用MPNST細胞の調製このプロトコルでは、細胞の特定の番号は、接ぎ木および腫瘍増殖の後の移植に必要な時間は、我々は経験的にST88 – 14細胞、NF1関連腫瘍5から派生した、一般的に使用されるMPNSTのラインのために決定したものです。我々が移植に使用する細胞は、安定して生物発光イメージング6によって識別ホタルのルシフェラーゼを発現するCMV -ルシフェラーゼ- IRES -ピューロマイシンカセットとクローンを含むレンチウイルスベクターを形質導入されています。我々はまた、安定的にCMV即時初期プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドでトランスフェクトMPNST細胞で実験を移植が行われている。我々はこれらのプラスミドベクターは、移植に続く式の絶滅を受けやすいということを発見したとして、我々はこれはお勧めしません。 ST88 – 14細胞を10％ウシ胎児血清、10μg/ mLのストレプトマイシンおよび10 IU / mLのペニシリン（DMEM10）を添加したダルベッコ最小必須培地中で増殖させる、5μg/ mlのピ​​ューロマイシンは、レンチウイルスベクターの選択を維持するために含まれています。我々は、50継代のために我々の研究室ではこれらの細胞を維持しており、これらの通路のいずれかの細胞の成長にどんな変化が確認されていません。 9 × 10 5 ST88 – 14細胞はフラスコが約80％コンフルエントとなる時点で、T175フラスコに播種し、3日間栽培されている。移植片35をマウスに、一台の80％コンフルエントT175フラスコが必要な場合、この密度では、ST88 – 14細胞のための私たちの平均利回りは、T175フラスコあたり7.3 × 10 6個の細胞です。それは細胞が移植のために収穫する前に合流するために成長することを許可されていないことが非常に重要です。我々は、移植細胞は移植の失敗の、より高度でコンフルエントフラスコの結果から収穫し、多くの場合、移植片の成長のin vivoでのコースに延長することを発見した。 ST88 – 14細胞は、室温のハンクス平衡塩溶液で1回リンスする。細胞を室温で30秒から1分のセルのストリッパーの細胞解離液を用いてフラスコから削除されます。 DMEM10の五ミリリットル（注：ピューロマイシンをこの培地に含まれていない ）使用されるセルのストリッパーの各ミリリットルあたりは、細胞に添加されています。 細胞を、血球計を使用してカウントされます。 3μLに懸濁した5 × 10 3 ST88 – 14細胞はマウス当たり注入されます。ピペッティングを考慮した移植片全体のコホートをするのに十分な細胞の量、エラー（例えば、35マウスのために、我々は一般的に移植片40のマウスへの十分な細胞数を転送する）、滅菌済み1.5 mLチューブに転送されます。細胞を5分間3000rpmで遠心分離されています。上清を注意深く除去し、細胞ペレットは、（注：ピューロマイシンをこの培地に含まれていない ）DMEM10に再懸濁されている3μLあたり5 × 10 3細胞の最終濃度に。氷上で細胞を維持する。 3。プロトコルを移植彼らはもはやつま先のピンチ刺激する彼らの後肢を撤回するまで、マウスは、イソフルラン気化器の誘導室内の麻酔はありません。マウスは、彼らの側に配置し、ブプレノルフィンのhydrocholorideの0.05 mg / kg体重を皮下注射されています。麻酔は、ノーズコーンを介して配信イソフルランの連続投与を介して維持されます。安楽死させたマウスがビデオのためのこの手順を示すために使用されたことに注意してください。従って、イソフルランの配信に使用されるイソフルランチューブはビデオには表示されません。 体温を維持するために、動物は、移植プロセス全体加熱パッドで処理されます。角膜乾燥を防ぐために、眼軟膏（Puralube獣医軟膏）の小滴は、それぞれの眼に投与される。それは一意に試験期間を通じて識別される各マウスに必要となるように、一意の識別子番号と耳標は、各マウスの右耳にクリップされます。 後脚を広げて、胃に動物を配置。移植が行われる外科ウィンドウ（側面）を公開し、滅菌ドレープでマウスをカバーしています。滅菌ドレープは鼻がコーン内部に残っていることを保証するために、呼吸や動物の色のモニタリングを可能にするために、両方の、頭の可視化を許可する必要があります。綿脇腹の中心に開始し、徐々に手術のウィンドウの端に外側に螺旋状に、アプリケーターをチップソーで手術部位にbetadineを適用します。 70％エタノールを、同じ方法で、手術部位に適用されます。エタノールに続くbetadineの連続した​​アプリケーションは、さらに2回繰り返されます。 氷とどちら穏やかにボルテックスからセルを削除するか、定住細胞を再懸濁するためにチューブをフリック。ピペットを用いて、細胞懸濁液3.2μLを削除し、パラフィルムの部分にそれを取り出してください。より必要以上に除去し、パラフィルムでサスペンションを置くことによって、我々は、懸濁液中に気泡がないことを確認し、我々は注射のための完全な3μLを持っていることを。 33ゲージの針を装備した10μLハミルトンシリンジに限り細胞懸濁液の可能性を引き出します。シリンジから気泡をフリックし、正確に3μLに過剰な細胞懸濁液を排出する。針は滅菌ままであることを保証するために、氷やバケツとの接触を認められていない使用可能な状態になるまで氷上で細胞と細胞含有注射器を持ちます。サランラップの一部は、直接氷に接触するからシリンジへの氷の上に置くことができます。 第22号手術用メスの刃を装備した4号メスのハンドルを使用して、すぐ下と平行大腿骨への脇腹の皮膚を通して切開を加えます。切開は外科的にスクラブフィールドの限界を超えて拡張していないことを確認してください。基本となる筋肉を露出させる手動で手術のクランプまたはで皮膚切開を開きます。筋膜面は、足の長さに沿って実行して反映されます。坐骨神経は、この下と筋膜によって接続された2つの筋肉の間に位置しています。鋭い先端がはさみのペアを使用して、太い糸の太さ約白い線状構造として明らかになるはず坐骨神経を、公開するには、この筋膜を通して解剖鈍らせる。 鋭い先端が曲がったピンセットを使用して、慎重に、基礎となる筋肉からそれを緩め、神経の下に解剖、これは両方の神経を上昇し、隔離します。この位置を維持するために神経の下に鉗子を残す。慎重に針が神経の下側を通して穿刺しないように、できるだけ神経と並行して注射の角度を維持しようとし、神経にハミルトンシリンジの針を挿入する。針が脊椎、我々は脊髄に向かって神経への腫瘍細胞の注射は、脊髄より緊密に移植した腫瘍細胞を確立することを発見したから遠位の神経の端に向かって挿入する必要があります。これが発生すると、腫瘍細胞はしばしば脊髄の機能を妥協することにより、研究グループからの動物の早期喪失、その結果、脊髄に侵入する。 針が適切に神経内に配置されると、鉗子によって神経で生産された緊張を緩和し、ゆっくりと45〜60秒かけて神経に注射器から細胞を注入する。それは急速に注射器の内容物の排除は、注入部位とその損失の周りの腫瘍細胞の"バックウォッシュ"につながるとして、これを徐々に行われることが不可欠です。すべてのセルが正常に注入された後、ゆっくりと注入材料の損失を最小限に抑えるために針を撤回。 のための削除]CEPSと慎重に筋肉の下に元の場所に戻して神経を置きます。 Vetbond外科接着剤で外科的切開を閉じます。接着剤を乾燥させるため約20秒のための鉗子と一緒に切開を保持する。 マウスは、イソフルランノーズコーンから削除し、回復するために寝具のないケージに単独で配置されます。動物が完全に回復するまで、このケージは、加熱パッドの上に保つ必要があります。回復のケージの一部が加熱パッド上にはないはず、これは彼らがあまりにも暖かく得れば動物は暑さから離れて移動することができます。移植後、動物は、サイト、跛行や食欲不振で、咀嚼のために定期的に評価すべきであるが、これらの兆候は、動物が苦痛に残っているし、その適切な鎮痛薬が与えられるべきである示している可能性があります。この手順で経験を積んだ後、我々は30〜40マウスが容易に一日に接ぎ木することができることを見出した。 4。研究グループに移植成功とランダム化の評価生物発光イメージングは​​、移植手順の成功を評価するために使用されます。我々は、その基板、D -ルシフェリンとルシフェラーゼの化学反応の結果として生成される腫瘍発現ホタルルシフェラーゼの発光を検出するためにIVIS – 100システムを（当初は現在キャリパー社として知られているXenogen、から）使用。これらの画像の分析は、特定の接木マウスは、治療的試験のコホートに入るために適しているかどうかを判断します。予備実験において、我々はメーカーのリビングイメージソフトウェアを使用して、関心分析の領域からの生物発光信号とそれらの腫瘍と相関腫瘍重量を収穫生物発光の検出可能なシグナル、犠牲に移植したマウスを、定量化している。これらの研究は、腫瘍移植片の重量および生物発光の発光との間の線形相関があったことが明らかにその生物発光イメージングは​​、前臨床試験の過程を通じて異種移植片の成長を評価するのに適切な代替手段だと指摘。同時に、通常、我々は画像5匹のマウスを。生物発光イメージングに関する追加の詳細については、以前は次の7を公開した。 移植の成功を評価するために、生物発光イメージングは​​、1を実行され、3日後の移植。画像は10分2.5mgのD -ルシフェリンの腹腔内注射後の同じ位置に指向マウスから収集されます。撮像中に、マウスは、イソフルラン麻酔とXenogenイメージャに存在する加熱パッドで37℃に保ち、体の温度の下で維持されています。画像取得時間は10分に2秒の範囲にあり、データ収集ソフトウェアはピクセルが画像の収集中に飽和されていないことを保証します。腫瘍領域（相対光子数/秒）からの発光はXenogenからプロプライエタリなソフトウェアを使用して測定されます。発光強度を同時に収集されているマウスの白黒写真の上にオーバーレイされる生物発光の擬似カラースケールで表現されます。 前臨床試験のコホートにおける適格であるためには、マウスが検出可能な生物発光シグナルの両方1と3日後の移植と生物発光シグナルの強度は1日目と3の間に増加させる必要がありますされている必要があります。減少または静的な信号を持っている動物は除外されます。さらに、同じ日に移植したマウスでは検出された信号は、お互いの1桁以内である必要があります。一桁低いまたは同じ日に移植した動物で検出されたものよりも高い生物発光シグナルを持つマウスも除外されます。 一度マウスはこれらの基準を満たし、彼らが治療群に無作為に割り付けでなければならないことを確認されている。これを達成するために、移植したマウスで検出されたルシフェラーゼのシグナルは、後の移植3日間は、最初に最上位から最下位の強度に順序付けされます。マウスはその後、治療群に強度のためにそれらを割り当てるこの順序を逆にして、すべてのマウスがグループに割り当てられるまで、プロセスを繰り返すことでグループに無作為です。たとえば、4治療群（例えば、プラセボと試験薬の3つの濃度）マウスがある場合には、注文1、2、3、4、4、3、2、1、1、2、3のグループに割り当てられます、4、4、3、2、1 ..等治療を開始する前に、割り当てられたグループの各メンバーで検出された生物発光シグナルは、すべてのグループ内の平均の開始信号を可能な限り閉じていることを確認するために平均化されています。候補治療薬の投与は3日目に開始されます。 治療薬は、治療の過程で移植片の成長に及ぼす影響を評価するために、生物発光イメージングは​​、最初の治療後の週（日10、17、24、30、ポスト移植）回実行されます。非ヌード免疫不全マウスの場合、それは動物が再び各イメージングセッションを実行する前にNairさんで取り除いた新しい毛皮の成長を持っていることが非常に重要です。これは、失われているどのくらいの信号の判別毛色と毛がブロック生物発光シグナルを、。例えば、次のような白い毛皮は、スイスのWに記載されています黒い毛皮が同じくらいの10倍9のような信号を減少させることができる一方ebsterマウスは、発光信号強度8で18％削減を生成します。我々はまた、それは均一な毛皮の毛は全ての投与群と投与群間の"正常化"シグナルの削減に発生することは仮定できないことに注意してくださいだろう。治療薬自体が髪の成長に影響を与える可能性があるためです。例えば、我々は、タモキシフェンの治療は、プラセボ投与マウスと比較した場合、それによって腫瘍の増殖にこのエージェントの知覚影響を最小限に抑え、発毛を阻害することを指摘している。 ST88 – 14 MPNSTの細胞を、マウスは30日後に移植のために行うことができます。この時点で、腫瘍は通常、制度的動物のケアと使用委員会によって許可された最大サイズに成長し、犠牲にする必要があります。最終的なイメージングセッションに続いて、マウスが殺され、治療成績のさらなる分析（例えば、治療薬の血中濃度の測定のための血液、ために必要な検体量測定、組織学の検討、Ki67の決定とTUNEL標識化インデックスのための腫瘍組織をと生化学的パラメータの評価は）収集した。正確には標本が収集されているか実験的なデザインのニーズに依存します。 腫瘍のあるマウスを毎日モニターし、終了する彼らが病気になった場合（不足通常のグルーミングと回避行動）、食べたり飲んだりすることができない、または腫瘍は、正常な身体の動きを阻害するとして過度に大きくなる場合する必要があります。全身腫瘍組織量は、動物の正常な体重の10％を超えることは許されるべきではない。体重の割合などの腫瘍重量は、年齢/性別マッチした対照動物の体重に担癌動物の体重を比較して算出されます。悪液質は、臨床的に有意になることを許されるべきではない。腫瘍を有する動物の体重減少は正常体重の20％を超えないようにしてください。 5。代表的な結果： 図1は、生物発光における典型的な漸進的増加が観察さを示して1〜18日後に移植ヌード（NIH III）マウス（AC）で適切に確立された同所性異種移植片で。生物発光シグナルの定量化は1〜24日、これらの信号が徐々に増加するものの、腫瘍の成長が著しく試験期間（図1D）の後の段階で加速し、ショーを移植後に観察。厳密にその腫瘍の成長を移植したマウスに発生した実証するために、我々は日常的にそれはその腫瘍が神経上膜を破裂し、軟組織と骨格筋の周囲、隣接する組織に浸潤している表示されている場合は、坐骨神経を収集し、。 MPNSTsの積極的な成長を考えると、それは我々が頻繁に移植した腫瘍細胞が神経の正常な障壁を突破し（図1E）隣接組織に浸潤していることを見つけることは驚くべきことではない。我々はまた、多くの場合、移植したMPNSTの細胞が神経に積極的に近位と移植部位より遠位に移行することを見つける。 図1。NIH IIIマウスの生物発光イメージングは、同所1日後の移植ルシフェラーゼタグ付きMPNST細胞を移植した（）。別のマウスでは、関心領域（ROI）内で検出された信号は、お互いの一桁内にすべてであることに注意してください。 10日間イメージの再作成（B）と18日間（C）ポスト移植生物発光の信号が徐々に個々のマウスに移植部位で増加することを示している。 （D）相対光子数の漸進的増加を示すグラフ/秒は1〜24日後の移植は、移植部位を介して検出された。 （E）このマウスから移植部位の顕微鏡写真は、隣接する骨格筋に腫瘍の増殖と焦点侵略を実証。