Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

1. La preparazione iniziale di topi immunodeficienti non nude (non necessario per Ceppi Nudità): Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati preventivamente dal UAB Cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa e condotto da personale adeguatamente addestrato. Abbiamo utilizzato con successo tre ceppi di topi immunodeficienti per questi esperimenti: a) Foxchase outbred topi SCID (CB17/lcr- Prkdc scid / lcrCrl topi), b) NIH III topi (NIHS-LYST bg Foxn1 nu Brk topi xid) e c )-SCIDγ topi NOD (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ topi). Nelle nostre mani, la crescita di xenotrapianti ortotopico è praticamente identico a NIH III e NOD-SCIDγ topi, entrambi portatori di mutazioni che interessano la funzione delle cellule T, cellule B e le cellule NK, per questo protocollo, il numero di giorni necessari per l'innesto la crescita, il momento in cui è iniziato la terapia ed i tempi di post-trapianto viene effettuato quando l'imaging sono quelli che abbiamo empiricamente determinato utilizzando topi NOD-SCIDγ. Crescita del trapianto in Foxchase outbred topi SCID, che hanno difetti di T e B, funzione delle cellule, in genere dura più a lungo. Per facilitare l'innesto di un gran numero di topi immunodeficienti non nudo, togliamo i capelli dal sito chirurgico nel pomeriggio prima del trapianto. I topi vengono anestetizzati con una camera isoflurano induzione collegato a un vaporizzatore per pulire con il gas di scarico. Per mantenere la temperatura corporea, gli animali vengono trattati su una piastra elettrica in tutto questo processo. Clippers sono utilizzati per eliminare i peli dalla metà-back fino al ginocchio della gamba posteriore sul lato che deve essere innestato. Tutti i capelli rimanenti viene accuratamente rimosso dal sito in ~ 5 minuti con un agente chimico depilatorio (ad esempio Nair, in particolare un prodotto con aloe vera per la pelle sensibile). La rimozione del prodotto depilatoria è raccomandato in quanto può causare irritazioni della pelle, degli occhi, e le superfici di altri enti ai quali potrebbe diffondersi. Non innesto entrambi i nervi sciatico in questi esperimenti in quanto ciò potrebbe compromettere la funzione gamba posteriore bilateralmente, con la conseguente perdita di topi da parte dei gruppi di studio. I topi sono autorizzati a recuperare completamente su una piastra elettrica in una gabbia di isolamento senza biancheria da letto; questo sia assicura che i topi non sono feriti da altri animali più pienamente vigile e impedisce loro di inalazione accidentale biancheria da letto. Quando i topi sono completamente mobili e non mostrano segni di stordimento, possono essere reintrodotti in una gabbia con altri topi. 2. Preparazione di cellule MPNST per iniezione nel Giorno del innesto In questo protocollo, il numero di cellule innestate e dei tempi necessari per la crescita tumorale post-trapianto sono quelli che abbiamo empiricamente determinato per ST88-14 cellule, una linea di uso comune MPNST che era derivato da un NF1 associate tumore 5. Le cellule che usiamo per l'innesto sono state trasdotte con un vettore lentivirale contenente una CMV luciferasi-IRES-puromicina cassetta e cloni che esprimono stabilmente luciferasi lucciola identificato da bioluminescenza immagini 6. Abbiamo anche eseguito l'innesto esperimenti con le cellule MPNST stabilmente transfettate con plasmidi che esprimono lucciola luciferasi sotto il controllo del promotore CMV immediato presto. Non è consigliabile questo che abbiamo trovato che questi vettori plasmidici sono inclini a sottoporsi estinzione di espressione seguente innesto. ST88-14 le cellule sono coltivate in terreno minimo indispensabile Dulbecco integrato con siero di vitello al 10% del feto, 10 mg / ml streptomicina e 10 IU / ml penicillina (DMEM10); 5 mcg / ml puromicina è incluso anche per mantenere la selezione per i vettori lentivirali. Abbiamo mantenuto queste cellule nel nostro laboratorio per 50 passaggi e non hanno osservato variazioni nella crescita cellulare in qualsiasi di questi passaggi. 9 x 10 5 ST88-14 cellule sono placcati in un pallone T175 e cresciuto per 3 giorni, momento in cui il pallone è di circa l'80% confluenti. Per innesto 35 topi, un singolo 80% confluenti T175 pallone viene richiesto; a questa densità, il nostro rendimento medio per ST88-14 cellule è 7,3 x 10 6 cellule per T175 pallone. E 'estremamente importante che le cellule non essere permesso di crescere fino a confluenza prima della raccolta per l'innesto. Abbiamo scoperto che le cellule raccolte da innesto confluenti risultati fiaschi in un grado più elevato di fallimento del trapianto e prolunga spesso in corso vivo della crescita del trapianto. ST88-14 cellule, una volta sciacquate con una soluzione salina bilanciata a temperatura ambiente Hanks '. Le cellule vengono rimosse dal pallone con Stripper cella cella di dissociazione soluzione per 30 secondi a 1 minuto a temperatura ambiente. Cinque millilitri di DMEM10 (Nota: puromicina non è incluso in questo mezzo) per ogni millilitro di Stripper cellule usate sono poi aggiunti alle cellule. Le cellule vengono conteggiati utilizzando un emocitometro. 5 x 10 3 ST88-14 cellule sospese in 3 ml verrà iniettato per mouse. Una quantità di cellule sufficiente per innestare l'intera coorte, con indennità per il pipettaggioerrore (ad esempio, per 35 topi, di solito trasferire un numero di cellule sufficiente per innestare 40 topi), viene trasferita in un tubo sterile 1,5 ml. Le cellule sono centrifugate a 3000 rpm per 5 minuti. Il surnatante viene accuratamente rimosso e il pellet risospeso in DMEM10 (Nota: puromicina non è incluso in questo mezzo) ad una concentrazione finale di 5 x 10 3 cellule per 3 ml. Mantenere le cellule in ghiaccio. 3. L'innesto Protocollo I topi vengono anestetizzati nella camera di induzione di un vaporizzatore isoflurano fino a quando non ritirare i loro arti posteriori ad uno stimolo pizzico dito del piede. I topi sono posti dalla loro parte e iniettata per via sottocutanea di 0,05 mg / kg di hydrocholoride buprenorfina. L'anestesia è poi mantenuta attraverso la somministrazione continua di isoflurano consegnato tramite il naso a cono. Si prega di notare che un topo eutanasia è stata usata per dimostrare la procedura per il video, di conseguenza, il tubo isoflurano usati per fornire isoflurano non è visibile nel video. Per mantenere la temperatura corporea, gli animali vengono trattati su una piastra elettrica per tutto il processo di innesto. Per prevenire l'essiccamento della cornea, una piccola goccia di pomata oftalmica (unguento Puralube veterinario) viene somministrato a ciascun occhio. In quanto sarà necessario per ogni mouse per essere identificato in modo univoco in tutto il processo, una marca auricolare con un numero identificativo univoco viene troncato per l'orecchio destro di ogni topo. Animale posto sullo stomaco, diffondendo le zampe posteriori. Coprire il mouse con una garza sterile, esponendo alla finestra chirurgica (fianco), dove l'innesto si verificherà. Il telino sterile dovrebbe consentire la visualizzazione della testa, sia per garantire che il naso è ancora dentro il cono e per consentire il monitoraggio della respirazione e il colore dell'animale. Applicare betadine al sito chirurgico con un applicatore con la punta di cotone, a partire dal centro del fianco e gradualmente a spirale verso l'esterno per i bordi della finestra chirurgica. Etanolo al 70% viene quindi applicata al sito chirurgico nella stessa maniera. Applicazioni consecutive di betadine seguito da etanolo sono ripetuti due volte. Rimuovere le cellule dal ghiaccio e sia delicatamente vortice o sfogliare la provetta per risospendere le cellule risolta. Usando una pipetta, rimuovere 3,2 ml di sospensione cellulare ed espellerlo su un pezzo di Parafilm. Eliminando più di quanto sia necessario e l'immissione della sospensione in Parafilm, possiamo garantire che non ci siano bolle in sospensione e che abbiamo un totale 3 ml per l'iniezione. Tirare la maggior quantità di sospensione cellulare possibile in una siringa da 10 L Hamilton dotato di un ago 33 gauge. Bolle Flick dalla siringa ed espellere la sospensione per eccesso di cellule esattamente 3 ml. Tenere le cellule e la cella contenente siringa sul ghiaccio fino al momento dell'uso, per assicurarsi che l'ago rimane sterile, non permettono il contatto con il ghiaccio o il secchio. Un pezzo di pellicola trasparente può essere posizionato sulla parte superiore del ghiaccio per la siringa dal diretto contatto con il ghiaccio. Usando un bisturi n ° 4 manico dotato di una lama di 22 N. bisturi, fare un'incisione attraverso la pelle del fianco appena sotto e parallelo al femore; fare in modo che l'incisione non si estende oltre i limiti del campo chirurgicamente rimosso. Aprire l'incisione cutanea con una pinza chirurgica o manualmente per esporre il muscolo sottostante. Un aereo fasciale sarà visibile per tutta la lunghezza della gamba, il nervo sciatico si trova sotto questo e tra i due muscoli collegati dalla fascia. Utilizzando un paio di forbici a punta tagliente, schietto sezionare attraverso questa fascia per esporre il nervo sciatico, che dovrebbe essere evidente come una struttura lineare bianco circa lo spessore di un filo di spessore. Utilizzando un paio di pinze curve appuntiti, con attenzione sezionare sotto il nervo, allentando dal muscolo sottostante, questo sia eleva e isola il nervo. Lascia la pinza sotto il coraggio di mantenere questa posizione. Inserire con cautela l'ago della siringa Hamilton nel nervo, cercando di mantenere l'angolo di iniezione in parallelo con il nervo possibile in modo che l'ago non puntura attraverso la parte inferiore del nervo. L'ago deve essere inserito verso la fine del nervo distale al rachide-abbiamo trovato che l'iniezione di cellule tumorali nel nervo verso il midollo spinale stabilisce le cellule tumorali innestati in una maggiore vicinanza al midollo spinale. In questo caso, le cellule tumorali spesso invadono il midollo spinale, con conseguente perdita prematura degli animali del gruppo di studio a causa di compromesso della funzione del midollo spinale. Una volta che l'ago è posizionato correttamente nel nervo, rilassare la tensione prodotta nel nervo dal forcipe e iniettare lentamente le cellule dalla siringa nel nervo più di 45-60 secondi. E 'essenziale che ciò avvenga lentamente, quanto più rapidamente l'espulsione dei contenuti siringa si tradurrà in un "back-wash" delle cellule tumorali in tutto il sito di iniezione e la loro perdita. Dopo tutte le cellule sono state iniettate con successo, estrarre lentamente l'ago per minimizzare la perdita di materiale iniettato. Per rimuovere ilporcini e con attenzione luogo nevralgico di nuovo nella sua posizione originale sotto il muscolo. Chiudere l'incisione chirurgica con Vetbond colla chirurgica. Tenere incisione insieme con una pinza per circa 20 secondi per consentire la colla per asciugare. Il mouse viene rimosso dal isoflurano naso-cono e messo da solo in un letto senza gabbia per recuperare. Questa gabbia deve essere tenuto in cima ad una piastra elettrica fino a quando l'animale ha pienamente recuperato. Parte della gabbia di recupero non dovrebbe essere su una piastra elettrica, questo permette all'animale di allontanarsi dal caldo, se troppo caldo. A seguito di innesto, gli animali devono essere valutati regolarmente per masticare nel sito, zoppia o anoressia; questi segni potrebbero indicare l'animale è ancora nel dolore e che gli analgesici corretta dovrebbe essere data. Dopo aver fatto esperienza con questa procedura, abbiamo scoperto che i topi 30-40 può essere facilmente innestato in un solo giorno. 4. Valutazione del successo del trapianto e randomizzazione in gruppi di studio L'imaging bioluminescenza è usato per valutare il successo della procedura di innesto. Usiamo un sistema IVIS-100 (originariamente da Xenogen, che ora è conosciuto come Calibri Inc.) per rilevare emissione di luce da tumore espresso luciferasi lucciola che si produce come risultato della reazione chimica della luciferasi con il suo substrato, D-Luciferin . Le analisi di queste immagini determinare se specifici topi innestate sono adatti per l'ingresso nel coorti sperimentazione terapeutica. In esperimenti preliminari, abbiamo quantificato i segnali rilevabili bioluminescenza, topi sacrificati innestate, raccolte le loro tumori e correlati pesi tumore con i segnali di bioluminescenza dalla regione di analisi di interesse utilizzando il software Vivere immagine del produttore. Questi studi hanno dimostrato che c'era una correlazione lineare tra il peso del tumore e trapianto emissione luminosa bioluminescenza, indicando che l'imaging bioluminescenza è un mezzo appropriato surrogato per valutare la crescita trapiantati in tutto il corso di studi preclinici. Tipicamente ci image 5 topi allo stesso tempo. Ulteriori dettagli sulla bioluminescenza immagini sono state pubblicate in precedenza 7. Per valutare il successo del trapianto, l'imaging bioluminescenza viene eseguita 1 e 3 giorni dopo l'innesto. Le immagini sono raccolte da topi orientate nella stessa posizione di 10 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale di 2,5 mg di D-Luciferin. Durante l'imaging, i topi sono mantenuti in anestesia isoflurano e la loro temperatura corporea mantenuta a 37 ° C da una piastra elettrica presenti nel imager Xenogen. Tempi di acquisizione delle immagini sono nella gamma di 2 sec a 10 min, il software di acquisizione dati assicura che nessun pixel sono saturati durante la raccolta delle immagini. Emissione di luce provenienti da regioni del tumore (conta fotone relativa / sec) è misurata utilizzando software proprietario da Xenogen. Intensità di emissione di luce è rappresentato dalla scala pseudocolore della bioluminescenza che è sovrapposto su fotografie in bianco e nero dei topi che sono raccolti nello stesso momento. Per essere ammessi per l'inclusione in una coorte di prova pre-clinici, i topi deve avere un segnale rilevabile bioluminescenza sia 1 e 3 giorni dopo l'innesto e l'intensità del segnale di bioluminescenza deve aumentare tra i giorni 1 e 3. Gli animali che hanno un segnale di diminuzione o statici sono esclusi. Inoltre, i segnali rilevati nei topi innestato lo stesso giorno dovrebbe essere entro 1 ordine di grandezza di ogni altro, i topi con segnali bioluminescenza che sono un ordine di grandezza inferiore o superiore a quelli rilevati negli animali innestati nello stesso giorno sono esclusi. Una volta che i topi sono stati identificati che rispondono a questi criteri, devono essere randomizzati in gruppi di trattamento. Per raggiungere questo obiettivo, i segnali luciferasi rilevato nei topi innestati 3 giorni dopo l'innesto vengono prima ordinati in ordine decrescente di intensità. I topi sono poi randomizzati in gruppi per l'assegnazione in ordine di intensità ai gruppi di trattamento, invertendo l'ordine e poi ripetendo il processo fino a quando tutti i topi vengono assegnati ai gruppi. Per esempio, se ci sono 4 gruppi di trattamento (ad esempio, placebo e tre concentrazioni di farmaco di prova) i topi sono assegnati ai gruppi in ordine 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. ecc Prima di iniziare il trattamento, i segnali bioluminescenza rilevato in ciascun membro del gruppo assegnato viene calcolata la media per assicurarsi che i segnali di partenza media all'interno di tutti i gruppi sono il più vicino possibile. La somministrazione di agenti terapeutici candidato è iniziata il giorno 3. Per valutare l'effetto terapeutico è l'agente di innesto sulla crescita nel corso del trattamento, l'imaging bioluminescenza viene effettuata una volta a settimana dopo la terapia iniziale (giorni 10, 17, 24, 30 post-trapianto). Per i topi immunodeficienti non nudo, è estremamente importante che gli animali hanno ancora una volta una nuova crescita pelliccia rimosso con Nair prima di eseguire ogni sessione di imaging. Questo perché i capelli blocca i segnali bioluminescenti, con colore del mantello determinare la quantità del segnale è perso. Per esempio, pelliccia bianca come si trova in Svizzera Webster topi produce una riduzione del 18% dell'intensità del segnale bioluminescente 8, mentre pelliccia nera può diminuire i segnali fino a 10 volte 9. Vorremmo inoltre notare che non si può presumere che la ricrescita pelo uniforme si verifichino in tutti i gruppi di trattamento e di "normalizzare" la riduzione del segnale tra i gruppi di trattamento. Questo perché l'agente terapeutico si può influenzare la crescita dei capelli. Per esempio, abbiamo notato che il trattamento con tamoxifene inibisce la ricrescita dei capelli, riducendo al minimo l'effetto percepito di questo agente sulla crescita tumorale rispetto ai topi trattati con placebo. Con ST88-14 MPNST cellule, i topi possono essere effettuate per 30 giorni post-trapianto. In questo momento, i tumori in genere hanno cresciuto alla dimensione massima consentita per la cura degli animali e dei comitati istituzionali uso e devono essere sacrificati. Dopo la sessione di imaging finale, i topi vengono uccisi ed i campioni necessari per l'ulteriore analisi dei risultati di trattamento (ad esempio, il sangue per la determinazione dei livelli circolanti di agente terapeutico, tessuto tumorale per la determinazione del peso, l'esame di istologia, la determinazione di Ki67 e indici di etichettatura e TUNEL valutazione dei parametri biochimici) raccolti. Esattamente ciò che i campioni vengono raccolti dipenderà dalle esigenze del disegno sperimentale. I topi con tumori dovrebbero essere monitorati giorno e risolto se si ammalano (grooming mancanza normali e comportamenti di evitamento), non sono in grado di mangiare o bere, o se il tumore diventa troppo grande da impedire i normali movimenti del corpo. Tumorale non dovrebbe essere consentito di superare il 10% del peso corporeo normale dell'animale. Peso del tumore come percentuale del peso corporeo viene calcolata confrontando il peso degli animali cuscinetto tumore al peso di età / sesso animali di controllo abbinati. Cachessia non dovrebbe essere permesso di diventare clinicamente significativo. Perdita di peso in animali portatori di tumore non deve superare il 20% del peso corporeo normale. 5. Rappresentante dei risultati: La figura 1 illustra l'aumento progressivo tipico bioluminescenza osservato 1-18 giorni post-trapianto in caso di trapianto ortotopico correttamente stabilito in un nudo (NIH III) mouse (CA). Quantificazione dei segnali bioluminescenza osservato 1-24 giorni dopo l'innesto mostra che, sebbene questi segnali progressivamente aumentare, la crescita tumorale accelera notevolmente nelle fasi successive del periodo di studio (Figura 1D). Per rigorosamente dimostrare che la crescita del tumore si è verificata nei topi innestati, ci vengono raccolti abitualmente il nervo sciatico e, se risulta che il tumore si è rotto epinevrio e invaso i tessuti adiacenti, che circonda i tessuti molli e muscolo scheletrico. Data la crescita aggressiva di MPNSTs, non sorprende che spesso troviamo che le cellule tumorali hanno innestato violato le normali barriere del nervo e hanno invaso i tessuti adiacenti (figura 1E). Abbiamo anche spesso che le cellule migrano MPNST innestato aggressivamente in nervo prossimale e distale al sito di innesto. Figura 1. Immagini bioluminescenza di NIH III del mouse ortotopicamente innestati con luciferasi-tagged cellule MPNST 1 giorno post-trapianto (A). Si noti che i segnali rilevati all'interno della regione di interesse (ROI) in diversi tipi di mouse sono tutti a un ordine di grandezza di ogni altro. Re-imaging 10 giorni (B) e 18 giorni (C) post-trapianto dimostra che i segnali bioluminescenti aumentare progressivamente nel sito del trapianto nei topi individuali. (D) Il grafico illustra il progressivo aumento del fotone relativi conteggi / secondo rilevata sul sito del trapianto 1-24 giorni post-trapianto. (E) Micrografia del sito trapianto da questo mouse che dimostrano la crescita del tumore e l'invasione focale nella adiacente muscolo scheletrico.