Orthotopic Xenografting של האדם בלוציפראז-Tagged ממאירה היקפיים נדן בתאי העצב גידול של In vivo בדיקה של סוכני המועמד טיפולית

1. הכנה ראשונית של Non-בעירום עכברים Immunodeficient (לא הכרחי עבור מתחים עירום): כל ההליכים היו נבדקה ואושרה מראש על ידי טיפול בבעלי חיים UAB המוסדי ועדת שימוש שנערך על ידי צוות מיומן כראוי. יש לנו בהצלחה השתמשו בשלושה זנים של עכברים immunodeficient לניסויים אלה: Foxchase) outbred עכברים SCID (CB17/lcr- Prkdc SCID / lcrCrl עכברים); ב) NIH III עכברים (NIHS-bg Lyst Foxn1 נו Brk עכברים xid); ג ) NOD-SCIDγ עכברים (NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ עכברים). בידיים שלנו, את הצמיחה של xenografts orthotopic הוא כמעט זהה ב-NIH III ו-NOD SCIDγ עכברים, שניהם נושאים מוטציות המשפיעות על תפקוד של תאים T, תאים B ותאי NK, עבור פרוטוקול זה, את מספר הימים הנדרשים שתל הצמיחה, את המועד שבו הטיפול הוא יזם פעמים שלאחר השתלת כאשר ההדמיה מתבצעת הן אלו שיש לנו נקבעים אמפירית תוך שימוש NOD-SCIDγ עכברים. צמיחה שתל ב Foxchase outbred עכברים SCID, אשר יש ליקויים בתפקוד-T ו-B-cell, בדרך כלל לוקח יותר זמן. כדי להקל על השתלת של מספר גדול של אי – עירום עכברים immunodeficient, אנו להסיר שיער מהאתר כירורגית בשעות אחר הצהריים לפני השתלת. עכברים מורדמים באמצעות תא אינדוקציה isoflurane המצורפת מאדה עם לחפש עבור הגז פסולת. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, חיות מטופלות על כרית חימום לאורך כל התהליך הזה. קליפרס משמשים להסרת שיער מאמצע בחזרה אל הברך של הרגל האחורית בצד שבו הוא להיות מורכבים. שיער כל שנותר הוא להסיר בזהירות מהאתר ב ~ 5 דקות באמצעות סוכן מקריח כימיים (למשל נאיר, ב מוצר מסוים עם אלוורה לעור רגיש). הסרת המוצר מקריח מומלץ כמו זה יכול להוביל לגירוי של העור, העיניים, ומשטחים גוף אחר, אשר עלול להתפשט. אנחנו לא שתל שני עצבים sciatic בניסויים אלה, מכיוון שהדבר עלול לפגוע באופן בילטרלי hindleg לתפקד, והתוצאה היא אובדן של עכברים של קבוצות לימוד. עכברים מותר להחלים לחלוטין על כרית חימום בכלוב בבידוד ללא מצעים, זה גם מבטיח כי עכברים לא נפגע, חיות אחרות יותר ערני לחלוטין ומונעת מהם בטעות שאיפת מצעים. כאשר עכברים ניידים מלא להראות שום עדות של שכרות, הם יכולים להיות שוב לתוך כלוב עם עכברים אחרים. 2. הכנת תאים MPNST עבור הזרקה ביום השתלת בפרוטוקול זה, מספר מסוים של תאים מורכבים ועל פי הנדרש הגידול שלאחר השתלת הם אלה שיש לנו נקבעים אמפירית עבור ST88-14 תאים, קו MPNST נפוץ כי נגזר הגידול NF1 הקשורים 5. התאים אנו משתמשים עבור השתלת כבר transduced עם וקטור lentiviral המכיל קלטת CMV-בלוציפראז-IRES-puromycin ו שיבוטים ביציבות להביע בלוציפראז גחלילית שזוהו על ידי פליטת אור הדמיה 6. ביצענו גם ניסויים עם השתלת תאים MPNST transfected ביציבות עם פלסמידים להביע גחלילית בלוציפראז בשליטה של ​​האמרגן CMV מיידית מוקדם. אנו לא ממליצים על זה כפי שמצאנו כי אלו וקטורים פלסמיד נוטים לעבור הכחדה של השתלת הבאים הביטוי. ST88-14 תאים גדלים בינוני חיונית מינימלית של Dulbecco בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין ו 10 IU / mL פניצילין (DMEM10); 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​puromycin נכלל גם כדי לשמור על הבחירה עבור וקטור lentiviral. שמרנו את התאים האלה במעבדה שלנו 50 מעברים לא הבחינו בשום וריאציה צמיחת תאים בכל הקטעים האלה. 9 x 10 5 ST88-14 תאים מצופה בבקבוק T175 גדל במשך 3 ימים, ובנקודה הבקבוק הוא כ 80% ומחוברות. כדי 35 עכברים שתל, יחיד 80% ומחוברות T175 בקבוק נדרש; בצפיפות זה, התשואה הממוצעת שלנו ST88-14 תאים הוא 7.3 x 10 6 תאים לכל בקבוק T175. חשוב ביותר כי התאים לא יוכלו לגדול מפגש לקראת קצירת עבור השתלת. מצאנו כי השתלת התאים שנקטפו מן התוצאות צלוחיות ומחוברות בדרגה גבוהה יותר של כשלון שתל ולעתים קרובות מאריך את הקורס in vivo של גידול השתל. ST88-14 תאים שטפה פעם עם תמיסת מלח בטמפרטורת החדר מאוזנת "הנקס. תאים יוסרו מן הבקבוק באמצעות חשפנית תא תא פתרון דיסוציאציה דקה 30 שניות עד 1 בטמפרטורת החדר. חמש מיליליטר של DMEM10 (הערה: puromycin אינו נכלל בינוני זה) למיליליטר אחד חשפנית נייד המשמש מתווספים אז אל התאים. תאים נספרים באמצעות hemocytometer. 5 x 10 3 ST88-14 תאים המרחפים μL 3 יהיה להזריק לכל עכבר. כמות של תאים מספיק שתל המחזור כולו, עם הקצבה pipettingשגיאה (למשל, עבור 35 עכברים, אנו בדרך כלל להעביר מספר תאים מספקת עד 40 עכברים שתל), מועבר לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל. התאים centrifuged בסל"ד 3000 למשך 5 דקות. Supernatant מוסר בזהירות התא גלולה resuspended ב DMEM10 (הערה: puromycin אינו נכלל המדיום הזה) לריכוז סופי של 5 x 10 3 תאים לכל μL 3. שמור את התאים על הקרח. 3. השתלת פרוטוקול עכברים מורדמים בחדר אינדוקציה של מאדה isoflurane עד שהם כבר לא לסגת hindlimb שלהם לגירוי קמצוץ הבוהן. עכברים ממוקמים בצד שלהם מוזרק תת עורי עם 0.05 מ"ג / ק"ג של hydrocholoride עצירות. הרדמה נשמר אז דרך ניהול מתמשך של isoflurane נמסר חרוט דרך האף. שים לב בעכברים מורדמים שימש כדי להדגים הליך זה עבור וידאו, וכתוצאה מכך, את צינור isoflurane המשמשת להעברת isoflurane אינו גלוי של וידאו. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, חיות מטופלות על כרית חימום לאורך כל תהליך השתלת. כדי למנוע התייבשות הקרנית, טיפה קטנה של משחת עיניים (משחה Puralube וטרינרי) ניתנת לכל עין. כאשר יהיה צורך עבור כל עכבר להיות מזוהה באופן ייחודי לכל אורך המשפט, תג אוזן עם מספר מזהה ייחודי הוא מוצמד לאוזן ימין של העכבר כל אחד. מקום חיות על הבטן, להפיץ הרגליים האחוריות. מכסים את העכבר עם וילון סטרילית, חושפים את החלון כירורגית (האגף) שבו השתלת תתרחש. לעטוף סטרילי צריך לאפשר הדמיה של הראש, הן על מנת להבטיח כי האף עדיין בתוך חרוט ולאפשר ניטור של הנשימה והצבע של החיה. החל בבטאדין לאתר כירורגית עם כותנה היטה המוליך, החל במרכז האגף ובהדרגה מתפתלת החוצה את הקצוות של החלון כירורגית. אתנול 70% מוחל אז לאתר כירורגית באותו אופן. יישומים ברציפות של בבטאדין ואחריו אתנול חוזרים עוד פעמיים. הסרת תאים קרח או מערבולת בעדינות או קפיצי התחתית resuspend תאים התיישבו. בעזרת פיפטה, להסיר 3.2 μL של ההשעיה התא להוציא את זה על גבי פיסת Parafilm. על ידי הסרת יותר הוא הצורך למקם את ההשעיה על Parafilm, אנו יכולים להבטיח כי אין בועות ההשעיה וכי יש לנו μL מלא 3 עבור הזריקה. משוך כמה שיותר ההשעיה תא האפשר לתוך מזרק 10 המילטון μL מצויד במחט 33 מד. בועות פליק מן המזרק ולגרש את ההשעיה תא עודפי μL 3 בדיוק. החזק את התאים את המזרק לתא המכיל על הקרח עד מוכן לשימוש, על מנת להבטיח כי המחט נשארת סטרילית, אינם מאפשרים מגע עם קרח או דלי. פיסת בניילון נצמד ניתן למקם על גבי הקרח כדי במזרק ישירות לפנות את הקרח. בעזרת ידית מס '4 אזמל מצויד להב מס' 22 אזמל, עושים חתך דרך העור של האגף ממש מתחת ובמקביל עצם הירך; לוודא כי החתך לא להרחיב מעבר לגבולות השדה שפשף בניתוח. פתח את החתך בעור עם מהדק כירורגי או באופן ידני כדי לחשוף את השרירים הבסיסית. מטוס fascial יהיה גלוי רץ לאורך של הרגל, העצב הנשה נמצא מתחת זו בין שני השרירים המחוברים על ידי fascia. בעזרת זוג מספריים מחודדים, בוטה לנתח דרך fascia זה כדי לחשוף את עצב השת, שאמור להיות ברור כמבנה ליניארי לבן על עובי של חוט עבה. בעזרת זוג מלקחיים מחודדים מעוקל, לנתח בזהירות תחת העצב, התרופפות אותו השריר הבסיס; זה גם מעלה את ומבודד העצב. השאירו את מלקחיים תחת העצב לשמור על עמדה זו. בזהירות להכניס את המחט של המזרק המילטון לתוך העצב, מנסה לשמור על זווית של הזריקה כפי במקביל העצב ככל האפשר, כך שהמחט לא לנקב דרך התחתון של עצב. המחט צריך להיות מוכנס לקראת סוף העצב הדיסטלי של עמוד השדרה, מצאנו כי הזרקה של תאים סרטניים לתוך העצב לכיוון חוט השדרה קובע את תאים סרטניים מורכבים בסמיכות קרובה יותר בעמוד השדרה. כאשר זה קורה, בדרך כלל בתאי הגידול לפלוש חוט השדרה, וכתוצאה מכך הפסד מוקדמת של החיה מקבוצת המחקר עקב פשרה של תפקוד עמוד השדרה. לאחר מחט ממוקם כראוי העצב, להרגיע את המתח המיוצר העצב על ידי מלקחיים לאט להזריק תאים מן המזרק לתוך העצב על פני 45-60 שניות. זה חיוני כי זה ייעשה לאט במהירות גירוש תוכן מזרק תגרום "לשטוף גב" של תאים סרטניים סביב הזריקה והפסד שלהם. לאחר שכל התאים מוזרקים בהצלחה, לאט לאט למשוך את המחט כדי להקטין את איבוד החומר המוזרק. הסרה עבורceps ובזהירות מקום העצב בחזרה למיקומו המקורי מתחת לשריר. סגור את חתך ניתוחי עם דבק כירורגי Vetbond. החזק חתך יחד עם מלקחיים כ 20 שניות על מנת לאפשר לדבק להתייבש. העכבר הוא להסיר את isoflurane האף קונוס והניח לבד בכלוב מצעים חופשי להתאושש. כלוב זה צריך להיות כל הזמן על החלק העליון של כרית חימום עד שהחיה התאוששה לחלוטין. חלק בכלובי ההתאוששות לא צריכה להיות על כרית חימום, זה מאפשר החיה להתרחק בחום אם הם להתחמם יותר מדי. בעקבות השתלת, החיות יש לבחון באופן קבוע לעיסה באתר, צליעה או אנורקסיה, סימנים אלו יכולים להצביע על החיה עדיין מכאבים כי משככי כאבים הנכון צריך להיות נתון. לאחר התנסות עם הליך זה, מצאנו כי עכברים 30-40 יכול בקלות להיות מורכבים ביום אחד. 4. הערכת ההצלחה אקראיות שוחד לקבוצות לימוד הדמיה פליטת אור משמש כדי להעריך את ההצלחה של ההליך השתלת. אנו משתמשים במערכת IVIS-100 (במקור Xenogen, הידוע כיום בשם מחוגה Inc) כדי לזהות פליטת האור של בלוציפראז גחלילית הגידול הביע כי הוא מיוצר כתוצאה של תגובה כימית של בלוציפראז עם המצע שלה, D-Luciferin . ניתוח של תמונות אלה לקבוע אם העכברים מורכבים ספציפיים מתאימים לכניסה המחזורים משפט טיפולית. בניסויים ראשוניים, יש לנו לכמת את האותות פליטת אור לזיהוי, עכברים מורכבים הקריב, שנקטפו הגידולים שלהם משקולות הגידול בקורלציה עם האותות פליטת אור מאזור ניתוחים עניין באמצעות תוכנה תמונה חיה של היצרן. מחקרים אלה הראו כי קיים מתאם לינארי בין משקולות שתל הגידול אור פליטה פליטת אור, המציין כי הדמיה פליטת אור הוא אמצעי חלופי הולם להערכת צמיחה xenograft ברחבי במהלך ניסויים פרה. בדרך כלל אנחנו תמונה 5 עכברים באותו זמן. פרטים נוספים על פליטת אור הדמיה פורסמו 7. על מנת להעריך את הצלחת השתל, הדמיה פליטת אור מבוצע 1 ו -3 ימים לאחר השתלת. תמונות נאספים מעכברים אוריינטציה ב 10 דקות באותו תפקיד לאחר ההזרקה intraperitoneal של 2.5 מ"ג D-Luciferin. במהלך הדמיה, עכברים נשמרות תחת הרדמה isoflurane ואת טמפרטורת הגוף שלהם כל הזמן על 37 מעלות צלזיוס על ידי כרית חימום נוכח imager Xenogen. רכישת פי תמונה הן בטווח של 2 דקות ל 10 שניות, התוכנה נתונים הרכישה מבטיחה כי אין פיקסלים רוויים במהלך איסוף התמונה. פליטת האור מאזורי הגידול (ספירת פוטון יחסית / sec) נמדד באמצעות תוכנה קניינית של Xenogen. עוצמת פליטת האור מיוצגת על ידי דרוג pseudocolor של פליטת אור כי הוא overlayed על צילומים בשחור לבן של עכברים נאספים באותו הזמן. כדי להיות זכאי להיכלל במדגם משפט פרה, עכברים חייב להיות אות פליטת אור לזיהוי הן 1 ו -3 ימים לאחר השתלת לבין עוצמת האות פליטת אור חייבים להגדיל ימים בין 1 ו -3. בעלי חיים שיש להם סימן קטן או סטטי אינן נכללות. בנוסף, אותות זוהה בעכברים מורכבים באותו יום צריך להיות תוך כדי 1 בסדר גודל של זה; עכברים עם אותות פליטת אור כי הם אחד בסדר גודל נמוך או גבוה יותר מאשר אלה שזוהו אצל בעלי חיים מורכבים באותו יום נכללות גם. לאחר עכברים זוהו עומד בקריטריונים אלו, הם חייבים להיות אקראית לקבוצות טיפול. כדי להשיג זאת, אותות בלוציפראז זוהה בעכברים מורכבים 3 ימים לאחר השתלת מסודרות הראשון הגבוהה ביותר בעוצמה הנמוכה ביותר. עכברים הם ואז אקראי לקבוצות ידי הקצאת אותם לפי סדר העוצמה קבוצות הטיפול, להפוך את הסדר, ואז חזרה על התהליך עד שכל העכברים מוקצים לקבוצות. לדוגמה, אם יש 4 קבוצות הטיפול (למשל, פלצבו ושלושה ריכוזים של התרופה מבחן) עכברים מוקצים לקבוצות לפי הסדר 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 וכו '.. לפני ביצוע הטיפול, אותות פליטת אור זוהה כל אחד מחברי הקבוצה שהוקצו בממוצע כדי לוודא את אותות המוצא הממוצע בתוך כל הקבוצות בעלות קרוב ככל האפשר. מינהל של הסוכן מועמד הטיפולית החלה ביום 3. כדי להעריך את השפעת הסוכן הטיפולי יש על הצמיחה השתל במהלך הטיפול, ההדמיה פליטת אור מתבצע פעם בשבוע אחרי תחילת הטיפול (ימים 10, 17, 24, 30 לאחר השתלת). עבור אי – עירום עכברים immunodeficient, חשוב ביקורתי כי שוב יש צמיחה חיות פרווה חדש הוסר עם נאיר לפני ביצוע כל טיפול הדמיה. זה בגלל השיער בלוקים אותות bioluminescent, עם צבע הפרווה בקביעת כמה האות אבוד. למשל, פרווה לבנה כמו נמצא על השוויצרי Webster עכברים מייצרת ירידה של 18% בעוצמת האות bioluminescent 8, בעוד פרווה שחור יכול להקטין אותות ככל 10 פי 9. היינו גם לציין כי לא ניתן להניח כי לצמיחה מחודשת פרווה אחיד תתרחש בכל קבוצות הטיפול "לנרמל" הפחתות אות בין קבוצות הטיפול. הסיבה לכך היא כי הסוכן הטיפולי עצמו עשוי להשפיע על צמיחת השיער. למשל, יש לנו לציין כי טיפול בטמוקסיפן מעכב לצמיחה מחודשת שיער, ובכך לצמצם את ההשפעה הנתפסת של הסוכן הזה על הגידול בהשוואה לפלצבו שטופלו עכברים. עם תאים ST88-14 MPNST, עכברים יכול להתבצע במשך 30 ימים לאחר השתלת. בשלב זה, בדרך כלל גידולים גדלו לגודל המקסימלי המותר על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השימוש חייב להיות קורבן. בעקבות הפגישה הדמיה הסופי, עכברים נהרגים דגימות הדרושים לצורך ניתוח נוסף של תוצאות הטיפול (למשל, דם לקביעת רמות במחזור של הסוכן הטיפולי, רקמת הגידול לקביעת משקל, בדיקת היסטולוגיה, קביעת Ki67 ומדדי TUNEL תיוג הערכה של פרמטרים ביוכימיים) אסף. בדיוק מה הדגימות נאספות יהיה תלוי על הצרכים של תכנון הניסוי. עכברים עם גידולים יש לעקוב מדי יום הסתיים אם הם נעשים חולים (חוסר הטיפוח הרגיל והתנהגויות הימנעות), אינם מסוגלים לאכול או לשתות, או אם הגידול הופך להיות גדול מדי כדי לעכב תנועת גוף תקין. נטל גידול לא צריך להיות מותר עולה על 10% משקל גוף תקין של החיה. גידול במשקל כאחוז ממשקל הגוף מחושב על ידי השוואת משקל של חיות נושאות גידולים למשקל של גיל / מין חיות בקרה מתאימים. תשישות אסור להיות משמעות קלינית. אובדן משקל נושאות גידולים בעלי חיים לא יעלה על 20% משקל גוף תקין. 5. נציג תוצאות: איור 1 מדגים את העלייה פרוגרסיבית אופיינית פליטת אור נצפתה 1-18 ימים לאחר השתלת ב xenograft orthotopic הוקמה כראוי עירום (NIH III) עכבר (AC). כימות של אותות פליטת אור נצפתה 1-24 ימים לאחר השתלת מראה כי, למרות אותות אלה להגדיל בהדרגה, הגידול ניכר מאיצה בשלבים מאוחרים יותר של תקופת המחקר (1D איור). כדי בקפדנות מראים כי הגידול שחל עכברים מורכבים, אנו שגרתי לאסוף את עצב השת, ואם נראה כי הגידול יש מקרע epineurium ופלשו לרקמות סמוכות, לרקמות הרכות בשרירי השלד. בהתחשב בצמיחה אגרסיבית של MPNSTs, אין זה מפתיע כי לעתים קרובות אנו מוצאים כי יש תאים סרטניים מורכבים הפר את המחסומים נורמלי של העצב ופלשו לרקמות סמוכות (איור 1E). כמו כן, אנו מוצאים כי התאים MPNST מורכבים להעביר באגרסיביות לתוך העצב הפרוקסימלית ומ דיסטלי לאתר השתל. באיור 1. הדמיה של פליטת אור NIH III עכבר מורכבים orthotopically עם תאים MPNST בלוציפראז-tagged 1 ביום שלאחר השתלת (A). שים לב לאותות זוהה בתוך האזור של עניין (ROI) של עכברים שונים בתוך כל סדר גודל אחד אחד את השני. Reimaging 10 ימים (ב) ו – 18 ימים (ג) לאחר השתלת מראה אותות bioluminescent בהדרגה להגדיל באתר שתל אצל עכברים בודדים. (ד) גרף הממחיש את הגידול מתקדמת הפוטון ספירת יחסית / שנייה זוהה על האתר שתל 1-24 ימים לאחר ההשתלה. (ה) Photomicrograph האתר שתל מן העכבר הזה הוכחת הגידול ואת הפלישה מוקד לתוך שריר השלד הסמוכים.