Orthotopique xénogreffe de l'homme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test d'agents thérapeutiques candidats

1. Préparation initiale de non-nudité des souris immunodéficientes (pas nécessaire pour les souches Nu): Toutes les procédures ont été examinés et approuvés au préalable par l'Institutional Animal Care UAB et du Comité utilisation et menée par un personnel correctement formé. Nous avons utilisé avec succès trois souches de souris immunodéficientes pour ces expériences: une Foxchase) consanguine souris SCID (CB17/lcr- Prkdc scid / lcrCrl souris), b) des NIH III souris (NIHS-bg Lyst Foxn1 nu Brk souris xid), et c ) NOD-SCIDγ souris (NOD.Cg-Prkdc scid IL2RG tm1Wjl / SZJ souris). Dans nos mains, la croissance de xénogreffes orthotopique est pratiquement identique au NIH III et NOD-SCIDγ souris, qui tous deux portent des mutations qui affectent la fonction des cellules T, cellules B et cellules NK, pour ce protocole, le nombre de jours requis pour greffe croissance, l'heure à laquelle le traitement est initié et les temps post-greffe lorsque l'imagerie est effectuée sont ceux que nous avons déterminé empiriquement en utilisant des souris NOD-SCIDγ. La croissance du greffon dans le Foxchase consanguine souris SCID, qui ont des défauts dans T et B la fonction des cellules, prend généralement plus de temps. Afin de faciliter la greffe d'un grand nombre de non-nudité des souris immunodéficientes, nous enlever les poils du site opératoire sur l'après-midi, avant la greffe. Les souris sont anesthésiées à l'aide d'une chambre d'induction isoflurane attaché à un vaporisateur avec piéger le gaz des déchets. Pour maintenir la température du corps, les animaux sont manipulés sur un coussin chauffant au long de ce processus. Clippers sont utilisés pour enlever les poils de la mi-bas vers le genou de la jambe arrière sur le côté qui doit être greffé. Toute cheveux restants sont soigneusement retirés du site dans ~ 5 minutes en utilisant un agent chimique dépilatoires (par exemple Nair, en particulier un produit à l'aloe vera pour les peaux sensibles). Retrait du produit dépilatoire est déconseillée car elle peut conduire à une irritation de la peau, les yeux et les surfaces du corps d'autres auxquels il pourrait se répandre. Nous ne sommes pas du greffon deux nerfs sciatiques dans ces expériences, car cela pourrait altérer la fonction membre postérieur bilatéral, résultant en la perte de la souris dans les groupes d'étude. Les souris sont autorisés à se remettre complètement sur un coussin chauffant dans une cage isolée, sans literie, ce qui assure à la fois que la souris ne sont pas blessés par d'autres, plus d'animaux en état d'alerte et les empêche d'aspiration accidentelle de la literie. Lorsque les souris sont totalement mobiles et ne montrent aucun signe d'grogginess, ils peuvent être réintroduits dans une cage avec d'autres souris. 2. Préparation des cellules MPNST pour injection sur le Jour de la greffe Dans ce protocole, le nombre de cellules greffées et le temps requis pour la croissance tumorale après la greffe sont ceux que nous avons déterminé empiriquement pour ST88-14 cellules, une ligne couramment utilisés MPNST qui a été dérivée d'une tumeur NF1 associée 5. Les cellules que nous utilisons pour la greffe ont été transduites avec un vecteur lentiviral contenant une cassette CMV-luciférase-IRES-puromycine et de clones exprimant de façon stable la luciférase de luciole identifiés par bioluminescence imagerie 6. Nous avons également procédé greffant des expériences avec des cellules transfectées de façon stable MPNST avec des plasmides exprimant la luciférase de luciole sous le contrôle du promoteur CMV précoce immédiat. Nous ne recommandons pas ce que nous avons constaté que ces vecteurs plasmidiques sont enclins à subir l'extinction de l'expression suivante greffe. ST88-14 cellules sont cultivées dans Dulbecco milieu essentiel minimal supplémenté avec 10% sérum de veau foetal, 10 pg / ml de streptomycine et 10 UI / ml de pénicilline (DMEM10); 5 ug / ml de puromycine est également inclus pour maintenir la sélection pour le vecteur lentiviral. Nous avons maintenu ces cellules dans notre laboratoire pour 50 passages et n'ont pas observé de variation dans la croissance cellulaire dans aucun de ces passages. 9 x 10 5 ST88-14 cellules sont étalées dans un flacon T175 et cultivés pendant 3 jours, à quel point le flacon est d'environ 80% de confluence. Pour greffer 35 souris, un seul 80% de confluence T175 flacon est nécessaire; à cette densité, notre taux de rendement moyen pour ST88-14 cellules est de 7,3 x 10 6 cellules par flacon T175. Il est extrêmement important que les cellules ne pas être autorisés à croître jusqu'à confluence avant la récolte pour le greffage. Nous avons constaté que les cellules greffes récoltées à partir des résultats des flacons confluents dans un degré plus élevé d'échec de la greffe et prolonge souvent au cours de la croissance in vivo du greffon. ST88-14 cellules sont rincées une fois avec solution à température ambiante Hanks salée équilibrée. Les cellules sont retiré du ballon à l'aide de cellules Stripper dissociation cellulaire solution pendant 30 secondes à 1 minute à température ambiante. Cinq millilitres de DMEM10 (Remarque: la puromycine n'est pas inclus dans ce milieu) par chaque millilitre de Stripper cellules utilisées sont ensuite ajoutés aux cellules. Les cellules sont comptées à l'aide d'un hémocytomètre. 5 x 10 3 ST88-14 cellules en suspension dans 3 pl seront injectés par souris. Une quantité suffisante de cellules à greffer la cohorte entière, avec l'allocation pour le pipetaged'erreur (par exemple, pour 35 souris, nous avons généralement le transfert d'un certain nombre de cellules suffisant pour greffer 40 souris), est transféré dans un tube de 1,5 ml stériles. Les cellules sont centrifugées à 3000 rpm pendant 5 minutes. Le surnageant est soigneusement enlevé et le culot cellulaire en suspension dans DMEM10 (Remarque: la puromycine n'est pas inclus dans ce milieu) à une concentration finale de 5 x 10 3 cellules par 3 pi. Gardez les cellules sur la glace. 3. La greffe Protocole Les souris sont anesthésiées dans la chambre de l'induction de l'isoflurane un vaporisateur jusqu'à ce qu'ils ne retirent leurs membres postérieurs à un stimulus pincement de l'orteil. Les souris sont placées sur le côté et la voie sous-cutanée de 0,05 mg / kg de hydrocholoride buprénorphine. L'anesthésie est alors maintenue par l'administration continue de l'isoflurane livrés par le nez conique. S'il vous plaît noter que les souris euthanasiées a été utilisé pour démontrer cette procédure pour la vidéo, par conséquent, les tubes utilisés pour fournir l'isoflurane isoflurane n'est pas visible dans la vidéo. Pour maintenir la température du corps, les animaux sont manipulés sur un coussin chauffant au long du processus de greffe. Pour éviter le dessèchement de la cornée, une petite goutte de pommade ophtalmique (onguent Puralube vétérinaires) est administrée à chaque oeil. Comme il sera nécessaire pour chaque souris d'être identifié de façon unique tout au long du procès, une étiquette d'oreille avec un numéro identifiant unique est accroché à l'oreille droite de chaque souris. Placer les animaux sur le ventre, la propagation pattes postérieures. Couvrir la souris avec un champ stérile, ce qui expose la fenêtre chirurgicale (flanc), où la greffe va se produire. Le champ stérile doit permettre la visualisation de la tête, à la fois pour s'assurer que le nez est encore à l'intérieur du cône et de permettre le suivi de la respiration et la couleur de l'animal. Appliquer la bétadine sur le site chirurgical avec un coton-tige, en commençant au centre du flanc et progressivement en spirale vers l'extérieur pour les bords de la fenêtre chirurgicale. 70% d'éthanol est ensuite appliqué au site chirurgical de la même manière. Applications consécutives de bétadine suivie d'éthanol sont répétées deux fois plus. Retirer les cellules de la glace et, soit légèrement vortex ou feuilleter le tube pour remettre les cellules réglée. Avec une pipette, enlever 3,2 pi de la suspension cellulaire et l'éjecter sur un morceau de parafilm. En supprimant plus que nécessaire et en plaçant la suspension sur Parafilm, nous pouvons nous assurer qu'il n'y a pas de bulles dans la suspension et que nous avons une gamme complète 3 pi pour l'injection. Tirez autant de la suspension cellulaire possible dans un 10 seringue Hamilton uL équipée d'une aiguille de calibre 33. Flick bulles de la seringue et d'expulser l'excès de suspension cellulaire à exactement 3 pl. Tenir les cellules et la seringue contenant les cellules sur la glace jusqu'au moment de servir, d'assurer que l'aiguille reste stérile, ne permettent pas de contact avec la glace ou du godet. Un morceau de Saran Wrap peut être placé sur le dessus de la glace à la seringue de contacter directement la glace. L'utilisation d'un bistouri n ° 4 gérer équipé d'une lame de bistouri n ° 22, faire une incision dans la peau du flanc juste en dessous et parallèlement au fémur; s'assurer que l'incision ne dépasse pas les limites du champ chirurgicalement nettoyée. Ouvrez l'incision cutanée avec une pince chirurgicale ou manuellement afin d'exposer le muscle sous-jacent. Un avion fasciale sera visible s'étendant le long de la jambe, le nerf sciatique qui se cache sous ce et entre les deux muscles reliés par le fascia. En utilisant une paire de ciseaux à bouts pointus-, émoussé par cette dissection du fascia pour exposer le nerf sciatique, ce qui devrait être évident comme une structure blanche linéaires environ l'épaisseur d'un fil épais. En utilisant une paire de pinces à forte pointe recourbée, soigneusement disséquer sous le nerf, il relâchement du muscle sous-jacent, ce qui à la fois élève et isole les nerfs. Laisser la pince sous le nerf de maintenir cette position. Insérez soigneusement l'aiguille de la seringue Hamilton dans le nerf, en essayant de maintenir l'angle d'injection en parallèle avec le nerf que possible afin que l'aiguille ne pas percer à travers la partie inférieure du nerf. L'aiguille doit être introduite vers la fin du nerf distal de la colonne vertébrale, nous avons constaté que l'injection de cellules tumorales dans le nerf vers la moelle épinière, établit les cellules tumorales greffées au plus près de la moelle épinière. Lorsque cela se produit, les cellules tumorales envahissent souvent la moelle épinière, résultant en la perte prématurée de l'animal du groupe d'étude en raison de compromis de la fonction de la moelle épinière. Une fois que l'aiguille est correctement positionné dans le nerf, se détendre la tension produite dans le nerf de la pince et injecter lentement les cellules de la seringue dans le nerf plus 45-60 secondes. Il est essentiel que cela soit fait lentement que rapidement l'expulsion du contenu de la seringue se traduira par un "back-wash» des cellules tumorales dans le site d'injection et de leur perte. Après toutes les cellules ont été injectées avec succès, lentement retirer l'aiguille pour minimiser la perte de matière injectée. Retirez le pourcèpes et placer soigneusement nerveuses de nouveau dans son emplacement d'origine sous le muscle. Fermer l'incision chirurgicale avec de la colle chirurgicale Vetbond. Tenir l'incision avec une pince pendant environ 20 secondes pour permettre à la colle de sécher. La souris est retirée de l'isoflurane nez conique et placé seul dans une cage literie-libre pour récupérer. Cette cage doit être maintenu sur le haut d'un coussin chauffant jusqu'à ce que l'animal a totalement récupéré. Une partie de la cage de récupération ne doit pas être sur un coussin chauffant, ce qui permet à l'animal de s'éloigner de la chaleur si elles deviennent trop chauds. Après la greffe, les animaux doivent être évalués régulièrement pour mâcher sur le site, la boiterie ou l'anorexie; ces signes pourraient indiquer que l'animal est encore dans la douleur et que les analgésiques comme il convient. Après une expérience avec cette procédure, nous avons constaté que les souris de 30 à 40 peuvent facilement être greffées dans une seule journée. 4. L'évaluation du succès du greffon et la randomisation dans l'étude Groupes L'imagerie par bioluminescence est utilisée pour évaluer le succès de la procédure de greffe. Nous utilisons un système IVIS-100 (originaire de Xenogen, qui est maintenant connu comme Étriers Inc) pour détecter l'émission de lumière à partir de tumeur exprimé luciférase de luciole qui est produite à la suite de la réaction chimique de la luciférase avec son substrat, D-luciférine . Les analyses de ces images spécifiques de déterminer si les souris greffées sont adaptés pour l'entrée dans les cohortes essai thérapeutique. Dans des expériences préliminaires, nous avons quantifié les signaux de bioluminescence détectable, sacrifié des souris greffées, récolté leurs tumeurs et corrélées poids des tumeurs avec les signaux de la région de la bioluminescence des analyses d'intérêt en utilisant le logiciel du fabricant vivante image. Ces études ont démontré qu'il y avait une corrélation linéaire entre le poids et la greffe tumorale émission de lumière par bioluminescence, indiquant que l'imagerie par bioluminescence est un moyen approprié de substitution de l'évaluation de la croissance de xénogreffes tout au long des essais précliniques. Typiquement, nous l'image 5 souris en même temps. Des détails supplémentaires sur l'imagerie par bioluminescence ont été publiées antérieurement 7. Pour évaluer le succès du greffon, l'imagerie par bioluminescence est effectuée 1 et 3 jours post-greffe. Les images sont recueillies à partir des souris orientée dans la position 10 min même après une injection intrapéritonéale de 2,5 mg de D-luciférine. Lors d'imagerie, les souris sont maintenues sous anesthésie à l'isoflurane et de leur température corporelle à 37 ° C par un coussin chauffant présente dans l'imageur Xenogen. Temps d'acquisition d'image sont de l'ordre de 2 sec à 10 min, le logiciel d'acquisition de données assure qu'aucune pixels sont saturés pendant la collecte d'images. L'émission de lumière provenant de régions tumorales (chiffres relatifs photons / s) est mesuré en utilisant un logiciel propriétaire de Xenogen. L'intensité d'émission de lumière est représentée par l'échelle de la bioluminescence pseudo qui est superposé sur des photos noir et blanc de la souris qui sont recueillis au même moment. Pour être admissible à l'inclusion dans une cohorte d'essai préclinique, des souris doit avoir un signal détectable à la fois la bioluminescence 1 et 3 jours post-greffe et l'intensité du signal de bioluminescence doit augmenter entre 1 et 3 jours. Les animaux qui ont un signal diminué ou statiques sont exclus. En outre, les signaux détectés chez les souris greffées sur le même jour devrait être dans une ordre de grandeur de l'autre; les souris avec des signaux de bioluminescence qui sont un ordre de grandeur inférieur ou supérieur à ceux détectés chez les animaux greffés sur le même jour sont également exclus. Une fois que les souris ont été identifiés qui répondent à ces critères, ils doivent être randomisés en groupes de traitement. Pour y parvenir, les signaux détectés dans la luciférase souris greffées 3 jours après la greffe sont tout d'abord du plus haut au plus faible intensité. Les souris sont ensuite randomisés en groupes en les assignant par ordre d'intensité pour les groupes de traitement, inverser cet ordre, puis répéter l'opération jusqu'à ce que toutes les souris sont affectés à des groupes. Par exemple, si il ya 4 groupes de traitement (par exemple, contre placebo et trois concentrations de médicament à l'essai) souris sont affectés aux groupes dans l'ordre 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. etc Avant de commencer le traitement, les signaux détectés dans la bioluminescence chaque membre du groupe affectés sont en moyenne de s'assurer que les signaux de départ moyen dans tous les groupes sont aussi proches que possible. L'administration de l'agent candidat thérapeutique est commencé le jour 3. Pour évaluer l'effet de l'agent thérapeutique sur la croissance du greffon au cours du traitement, l'imagerie par bioluminescence est effectuée une fois par semaine après le début du traitement (jours 10, 17, 24, 30 post-greffe). Pour les non-nude souris immunodéficientes, il est extrêmement important que les animaux ont à nouveau une croissance de fourrure nouvelle enlevé avec Nair avant de procéder à chaque session d'imagerie. C'est parce que les cheveux des blocs de signaux bioluminescents, avec la couleur du pelage de déterminer quelle quantité de signal est perdu. Par exemple, la fourrure blanche comme on en trouve sur Swiss WWebster souris provoque une réduction de 18% de l'intensité du signal bioluminescent 8, tandis que la fourrure noire peut diminuer les signaux jusqu'à 10 fois 9. Nous aimerions aussi noter qu'il ne peut pas être supposé que la repousse de fourrure uniforme se fera dans tous les groupes de traitement et de «normaliser» le signal réductions parmi les groupes de traitement. C'est parce que l'agent thérapeutique elle-même peut affecter la croissance des cheveux. Par exemple, nous avons noté que le traitement au tamoxifène inhibe la repousse des cheveux, minimisant ainsi l'effet perçu de cet agent sur la croissance tumorale par rapport au placebo chez les souris traitées. Avec les cellules ST88-14 MPNST, les souris peuvent être effectuées pendant 30 jours post-greffe. A cette époque, les tumeurs ont généralement atteint la taille maximale autorisée par les soins des animaux et des comités institutionnels utilisation et doivent être sacrifiés. Après la séance d'imagerie finale, les souris sont tuées et échantillons nécessaires pour une analyse approfondie des résultats du traitement (par exemple, du sang pour la détermination des taux circulants de l'agent thérapeutique, le tissu tumoral pour la détermination du poids, l'examen de l'histologie, la détermination de Ki67 et indices de marquage TUNEL et l'évaluation des paramètres biochimiques) collectées. Précisément ce que les échantillons sont prélevés dépendra des besoins de la conception expérimentale. Souris présentant des tumeurs doit être surveillée quotidiennement et a mis fin si elles tombent malades (manque de toilettage normal et les comportements d'évitement), sont incapables de manger ou boire, ou si la tumeur devient trop grande pour gêner les mouvements normaux du corps. Charge tumorale ne devraient pas être autorisés à dépasser 10% du poids de l'animal normal du corps. Poids de la tumeur en tant que pourcentage du poids du corps est calculé en comparant le poids de l'animal portant une tumeur au poids de l'âge / le sexe des animaux témoins appariés. La cachexie ne devraient pas être autorisés à devenir cliniquement significative. La perte de poids dans les animaux porteurs de tumeurs ne doit pas dépasser 20% du poids corporel normal. 5. Les résultats représentatifs: La figure 1 illustre l'augmentation progressive typique en bioluminescence observée 1 à 18 jours post-greffe dans une xénogreffe orthotopique correctement établie dans un nu (NIH III) de la souris (AC). Quantification des signaux de bioluminescence observée 1-24 jours après la greffe montre que, bien que ces signaux d'augmenter progressivement, la croissance tumorale accélère nettement dans les étapes ultérieures de la période d'étude (figure 1D). Pour rigoureusement démontrer que la croissance tumorale chez la souris a eu lieu greffés, nous recueillons automatiquement le nerf sciatique et, s'il apparaît que la tumeur a rompu l'épinèvre et envahit les tissus adjacents, des tissus mous environnants et le muscle squelettique. Compte tenu de la croissance agressive de MPNSTs, il n'est pas surprenant que nous constatons souvent que les cellules tumorales greffées ont violé les barrières normales du nerf et a envahi les tissus adjacents (figure 1E). Nous avons aussi souvent que les cellules greffées MPNST migrer agressivement dans le nerf proximales et distales du site de la greffe. Figure 1. Imagerie par bioluminescence des NIH III de souris greffées avec orthotopique luciférase taggés cellules MPNST un jour après la greffe (A). Notez que les signaux détectés dans la région d'intérêt (ROI) dans différentes souris sont tous dans un ordre de grandeur de l'autre. Réimagerie 10 jours (B) et 18 jours (C) l'après-greffes montre que les signaux bioluminescents augmenter progressivement au site de la greffe chez les souris individuelles. (D) Graphique illustrant l'augmentation progressive dans le photon relatifs coups / seconde détecté sur le site du greffon 1-24 jours post-greffe. (E) Microphotographie de la site de la greffe à partir de cette souris montrant la croissance tumorale et l'invasion focale dans le muscle squelettique adjacentes.