Orthotope Xenografting van de Mens Luciferase-label maligne perifere zenuwschede tumorcellen voor In vivo Het testen van de kandidaat-therapeutische middelen

1. Eerste voorbereiding van niet-naakt immunodeficiënte muizen (niet nodig voor Naakt stammen): Alle procedures werden herzien en goedgekeurd door de UAB Institutional Animal Care en gebruik Comite en uitgevoerd door goed opgeleid personeel. We hebben met succes gebruikt drie stammen van immunodeficiënte muizen voor deze experimenten: a) Foxchase outbred SCID muizen (CB17/lcr- Prkdc SCID / lcrCrl muizen), b) NIH III muizen (NIHS-Lyst bg Foxn1 nu Brk XID muizen), en c ) NOD-SCIDγ muizen (NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ muizen). In onze handen, de groei van de orthotope xenografts is vrijwel identiek in NIH III en NOD-SCIDγ muizen, die beide dragen mutaties die de functie van T-cellen, B cellen en NK-cellen, voor dit protocol, het aantal dagen dat nodig is voor het kweken van groei, het tijdstip waarop de therapie wordt gestart en de tijd na de enting bij beeldvorming wordt uitgevoerd zijn die we hebben empirisch bepaald met behulp van NOD-SCIDγ muizen. Graft groei in Foxchase outbred SCID muizen, die defecten in T-en B-cel functie hebben, meestal duurt het langer. Ter bevordering van enten van grote aantallen niet-naakt immunodeficiënte muizen, verwijderen we haar van de operatiewond op de middag voorafgaand aan de transplantatie. Muizen zijn verdoofd met behulp van een isofluraan inductie kamer aan een vaporizer met vangen voor het afgas. Te onderhouden lichaamstemperatuur, worden dieren behandeld op een verwarmingselement in dit hele proces. Klippers worden gebruikt om de haren te verwijderen uit het midden van de terug naar de knie van het achterste been aan de kant die moet worden geënt. Eventuele resterende haar wordt zorgvuldig verwijderd van de site in ~ 5 minuten met behulp van een chemisch ontharingsmiddel (bijv. Nair, in het bijzonder een product met aloë vera voor de gevoelige huid). Het verwijderen van de ontharingsmiddelen product wordt aanbevolen als het kan leiden tot irritatie van de huid, ogen en andere lichaamsdelen oppervlakken waarmee het zou kunnen verspreiden. Wij hebben geen graft zowel ischiadicus zenuwen in deze experimenten, omdat dit kan bilateraal achterbeen functie aantasten, wat resulteert in het verlies van muizen uit de studie groepen. Muizen zijn toegestaan ​​om volledig te herstellen van een verwarmingselement in een geïsoleerde kooi zonder beddengoed, dit zowel zorgt ervoor dat de muizen niet gewond raken door andere, meer volledig alert dieren en voorkomt dat ze per ongeluk inademen van beddengoed. Bij de muizen zijn volledig mobiel en tonen geen tekenen van onzekerheid, kunnen ze worden opnieuw in een kooi met andere muizen. 2. De voorbereiding van MPNST Cellen voor injectie op de Dag van enten In dit protocol, de specifieke nummers van cellen geënt en de tijd die nodig is voor de groei van tumoren na enten zijn die we empirisch hebben vastgesteld voor de ST88-14 cellen, een veelgebruikte MPNST lijn die was afgeleid van een NF1-geassocieerde tumor 5. De cellen die we gebruiken voor het enten van zijn getransduceerd met een lentivirale vector die een CMV-luciferase-IRES-puromycine cassette en klonen stabiel uiten vuurvlieg luciferase geïdentificeerd door bioluminescentie beeldvorming 6. Wij hebben eveneens de enting experimenten met MPNST cellen die stabiel getransfecteerd met plasmiden uitdrukken vuurvlieg luciferase onder de controle van de CMV immediate early promotor. We raden dit omdat we hebben gemerkt dat deze plasmide vectoren zijn gevoelig voor uitsterven van meningsuiting na enten ondergaan. ST88-14 cellen worden gekweekt in minimaal essentieel medium Dulbecco's aangevuld met 10% foetaal kalf serum, 10 ug / ml streptomycine en 10 IU / ml penicilline (DMEM10), 5 ng / ml puromycine is ook opgenomen om de selectie te behouden voor de lentivirale vector. We hebben gehandhaafd deze cellen in ons laboratorium voor 50 passages en zijn niet waargenomen geen variatie in de celgroei in een van deze passages. 9 x 10 5 ST88-14 cellen uitgeplaat in een T175 kolf en geteeld voor drie dagen, waarna de kolf is ongeveer 80% confluent. Om te enten 35 muizen, is een enkele 80% confluent T175 fles nodig; op deze dichtheid, onze gemiddelde opbrengst voor ST88-14 cellen is 7,3 x 10 6 cellen per T175 kolf. Het is van cruciaal belang dat de cellen niet worden toegestaan ​​om voor te groeien tot confluentie de oogst voor enten. We hebben ontdekt dat het enten cellen geoogst van samenvloeiende kolven resulteert in een hogere mate van graft falen en vaak verlengt de in vivo loop van de graft groei. ST88-14 cellen worden eenmaal gespoeld met gebalanceerde zoutoplossing kamertemperatuur Hanks '. Cellen worden verwijderd uit de kolf met behulp van Cell Stripper cel dissociatie oplossing gedurende 30 seconden tot 1 minuut bij kamertemperatuur. Vijf milliliter DMEM10 (Let op: puromycine is niet inbegrepen in dit medium) per per milliliter van de gebruikte Cell Stripper worden vervolgens toegevoegd aan de cellen. Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer. 5 x 10 3 ST88-14 cellen gesuspendeerd in drie ui wordt geïnjecteerd per muis. Een hoeveelheid van cellen voldoende is om te enten de hele cohort, met een toelage voor pipetterenfout (bijvoorbeeld, voor 35 muizen, hebben we meestal de overdracht van een aantal cellen voldoende is om te enten 40 muizen), wordt overgebracht in een steriele 1,5 ml buis. De cellen worden gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 5 minuten. Het supernatant wordt zorgvuldig verwijderd en de celpellet geresuspendeerd in DMEM10 (Opmerking: puromycine is niet opgenomen in dit medium) tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 3 cellen per microliter 3. Houd de cellen op ijs. 3. Enten Protocol Muizen worden verdoofd in de inductie kamer van een isofluraan vaporizer totdat ze niet langer hun achterbeen te trekken om een ​​teen knijpen stimulus. Muizen zijn gelegd op hun kant en subcutaan geïnjecteerd met 0,05 mg / kg van buprenorfine hydrocholoride. Anesthesie wordt dan onderhouden via continue toediening van isofluraan geleverd via de neus-cone. Houdt u er rekening mee dat een ingeslapen muizen werd gebruikt om deze procedure voor de video te tonen; dus de isofluraan slangen gebruikt voor het afleveren isofluraan niet zichtbaar is in de video. Te onderhouden lichaamstemperatuur, worden dieren behandeld op een verwarmingselement gedurende het enten proces. Om te voorkomen dat het hoornvlies uitdroging, een kleine daling van de oogzalf (Puralube veterinaire zalf) wordt toegediend aan elk oog. Aangezien het nodig zal zijn voor elke muis op unieke vast te stellen in het proces, is een oormerk met een uniek identificatienummer geklemd aan het rechteroor van elke muis. Plaats dier op de buik, het verspreiden van achterpoten. Bedek de muis met een steriel laken, waardoor de chirurgische venster (flank), waar enten zal voordoen. De steriele laken moet het mogelijk maken visualisatie van het hoofd, zowel om ervoor te zorgen dat de neus nog steeds in de kegel en de monitoring van de ademhaling en het dier kleur toe te staan. Betadine van toepassing op de chirurgische site met een katoenen tip applicator, te beginnen in het midden van de flank en geleidelijk spiraalsgewijs naar buiten om de randen van de chirurgische venster. 70% ethanol wordt vervolgens toegepast op de operatiewond op dezelfde manier. Opeenvolgende toepassingen van betadine, gevolgd door ethanol worden herhaald twee keer meer. Verwijder de cellen van ijs en ofwel zachtjes vortex of flick de buis aan de vaste cellen te mengen. Met behulp van een pipet, verwijder dan 3,2 pi van de celsuspensie en uitwerpen deze op een stuk van Parafilm. Door het verwijderen van meer dan nodig is en het plaatsen van de ophanging op Parafilm, kunnen we ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de ophanging en dat we een volledige 3 pi voor de injectie. Trek zoveel mogelijk van de celsuspensie mogelijk in een 10 pi Hamilton injectiespuit met een 33 gauge naald. Flick luchtbellen uit de spuit en verdrijven de overtollige celsuspensie precies 3 pi. Houd de cellen en de cel-bevattende spuit op het ijs pas klaar voor gebruik, om ervoor te zorgen dat de naald steriel blijft, geen contact mogelijk is met het ijs of de emmer. Een stuk van Saran Wrap kan worden geplaatst op de top van het ijs om de spuit van direct contact met het ijs. Met behulp van een scalpel nr. 4 handgreep voorzien van een nr. 22 scalpel, maken een incisie door de huid van de flank net onder en parallel aan het dijbeen, zorg ervoor dat de snede niet verder gaan dan de grenzen van het chirurgisch veld geschrobd. Open de huid incisie met een chirurgische klem of handmatig aan de onderliggende spieren bloot te leggen. Een fasciaal vliegtuig zal zichtbaar zijn langs de lengte van het been, de heupzenuw ligt onder deze en tussen de twee spieren met elkaar verbonden door de fascia. Met behulp van een paar scherpe tip-schaar, bot te ontleden door middel van deze fascia aan de heupzenuw, dat moet duidelijk zijn als een witte lineaire structuur over de dikte van een dikke draad bloot te leggen. Met behulp van een paar scherpe-tip gebogen pincet voorzichtig ontleden onder de zenuw, los uit de onderliggende spier, dit zowel verheft en isoleert de zenuw. Laat de tang onder het lef om deze positie te handhaven. Steek de naald van de spuit in Hamilton de zenuw, in een poging om de hoek van de injectie te handhaven als parallel met de zenuw mogelijk, zodat de naald niet prikken via de onderkant van de zenuw. De naald moet worden ingebracht tegen het einde van de zenuw distaal van de wervelkolom, we hebben gevonden dat de injectie van tumorcellen in de zenuw naar het ruggenmerg de geënte tumorcellen vestigt in dichter bij het ruggenmerg. Wanneer dit gebeurt, de tumorcellen vaak binnen te dringen het ruggenmerg, wat resulteert in voortijdig verlies van het dier uit de studie groep als gevolg van een compromis van het ruggenmerg functie. Zodra de naald correct is gepositioneerd in de zenuw, ontspan de spanning die in de zenuw door de tang en langzaam cellen uit de spuit te injecteren in de zenuw meer dan 45-60 seconden. Het is essentieel dat dit langzaam gebeurt zo snel verdrijving van de spuit inhoud zal resulteren in een "back-wash" van tumorcellen rondom de injectieplaats en hun verlies. Nadat alle cellen met succes geïnjecteerd, langzaam terug te trekken van de naald om het verlies van de geïnjecteerde materiaal te minimaliseren. Verwijder de voor deeekhoorntjesbrood en voorzichtig terug plaatsen zenuw in zijn oorspronkelijke locatie onder de spier. Sluit de incisie met Vetbond chirurgische lijm. Bij elkaar te houden incisie met een pincet voor ongeveer 20 seconden tot de lijm droog is. De muis is verwijderd uit de isofluraan neuskegel en geplaatst alleen in een bedding zonder kooi te herstellen. Deze kooi moet worden bewaard op de top van een verwarmings-pad totdat het dier volledig is hersteld. Een deel van het herstel kooi mag niet op een verwarmingselement, dit stelt het dier weg te bewegen van de hitte als ze te warm. Na enten, moeten de dieren regelmatig worden beoordeeld voor het kauwen op de site, kreupelheid of anorexia, deze signalen kunnen wijzen op het dier is nog steeds pijn en dat een goede pijnstillers moet worden gegeven. Na ervaring te hebben opgedaan met deze procedure, hebben we ontdekt dat 30-40 muizen gemakkelijk kunnen worden geënt in een enkele dag. 4. Beoordeling van Graft Succes en Randomisatie Into Study groepen Bioluminescentie imaging wordt gebruikt om het succes van de transplantatie procedure te beoordelen. We maken gebruik van een IVIS-100 systeem (oorspronkelijk uit Xenogen, dat nu bekend staat als Remklauwen Inc) aan het licht emissie detecteren van tumor-geuit vuurvlieg luciferase dat geproduceerd wordt als gevolg van de chemische reactie van luciferase met zijn substraat, D-Luciferine . Analyses van deze beelden vast te stellen of specifieke geënt muizen zijn geschikt voor toegang tot de therapeutische trial cohorten. In inleidende experimenten, hebben we gekwantificeerd de bioluminescentie signalen waarneembaar, opgeofferd geënt muizen, geoogst hun tumoren en gecorreleerd tumoren gewichten met de signalen van bioluminescentie gebied van belang analyses met behulp van de fabrikant Living Image Software. Deze studies toonden aan dat er een lineaire correlatie tussen tumor graft gewichten en bioluminescentie lichtemissie, wat aangeeft dat bioluminescentie beeldvorming is een geschikt surrogaat middelen voor beoordeling van xenograft groei in de loop van de preklinische proeven. Typisch we afbeelding 5 muizen op hetzelfde moment. Bijkomende details over bioluminescentie imaging zijn eerder gepubliceerde 7. Voor de beoordeling van graft succes, is bioluminescentie beeldvorming uitgevoerd 1 en 3 dagen na de enting. Beelden worden verzameld van muizen georiënteerd zijn in dezelfde positie 10 min na intraperitoneale injectie van 2,5 mg D-Luciferine. Tijdens de beeldvorming, zijn muizen onderhouden onder isofluraan anesthesie en hun lichaamstemperatuur bewaard bij 37 ° C door een verwarmingselement aanwezig is in de Xenogen imager. Beeldacquisitie tijden zijn in het bereik van 2 sec tot 10 min, de data-acquisitie software zorgt ervoor dat er geen pixels verzadigd zijn tijdens de foto collectie. Licht emissie van tumor regio's (relatieve foton tellingen / sec) wordt gemeten met behulp van gepatenteerde software van Xenogen. Licht emissie-intensiteit wordt vertegenwoordigd door pseudocolor schaling van de bioluminescentie dat is overlayed op zwart-wit foto's van de muizen die worden verzameld op hetzelfde moment. Om in aanmerking te komen voor opname in een preklinische studie cohort, moet muizen hebben een detecteerbaar bioluminescentie signaal zowel 1 en 3 dagen na de enting en de intensiteit van de bioluminescentie signaal moet stijging tussen dag 1 en 3. Dieren die een verminderde of statisch signaal hebben, worden uitgesloten. Daarnaast moet signalen waargenomen bij muizen geënt op dezelfde dag binnen een orde van grootte van elkaar; muizen met bioluminescentie signalen die een orde van grootte hoger of lager zijn dan die vastgesteld bij dieren geënt op dezelfde dag zijn eveneens uitgesloten. Zodra muizen hebben geïdentificeerd die aan deze criteria voldoen, moeten zij worden gerandomiseerd in behandelgroepen. Om dit te bereiken, luciferase signalen gedetecteerd in geënt muizen drie dagen na enten zijn in de eerste opdracht van de hoogste naar laagste intensiteit. Muizen worden vervolgens gerandomiseerd in groepen door ze in volgorde van intensiteit van de behandelgroepen, achteruitrijden dit besluit en vervolgens het proces te herhalen totdat alle muizen worden toegewezen aan groepen. Bijvoorbeeld, zijn als er vier behandelingsgroepen (bijvoorbeeld, placebo en drie concentraties van de te testen medicijn) muizen is toegewezen aan de groepen in de volgorde 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. etc. Voor het begin van de behandeling worden de bioluminescentie signalen gedetecteerd in elk lid van de toegewezen groep gemiddeld om ervoor te zorgen dat de gemiddelde start signalen binnen alle groepen zo dicht mogelijk. Het beheer van de kandidaat therapeutisch middel is begonnen op dag 3. Voor de beoordeling van het effect van de therapeutische middel heeft op de graft groei in de loop van de behandeling wordt bioluminescentie imaging een keer per week na het begin van de behandeling (dag 10, 17, 24, 30 post-enten). Voor niet-naakt immunodeficiënte muizen, is het uitermate belangrijk dat de dieren weer nieuwe vacht groei verwijderd worden met Nair voorafgaand aan het uitvoeren van elke imaging sessie. Dit komt omdat het haar blokken bioluminescente signalen, met een kleur van de vacht bepalen hoeveel van het signaal verloren gaat. Zo is witte vacht, zoals te vinden op de Zwitserse WEbster muizen levert een 18% reductie in bioluminescente signaalintensiteit 8, terwijl de zwarte vacht kan verminderen signalen zo veel als 10-voudige 9. Zouden we ook rekening mee dat het niet kan worden aangenomen dat een uniforme vacht hergroei zal in alle behandelingsgroepen en "normaal"-signaal reducties in de verschillende behandelingsgroepen. Dit komt omdat het therapeutische middel zelf kan invloed hebben op de haargroei. Zo hebben we opgemerkt dat tamoxifen behandeling haargroei remt, om zo de waargenomen effect van dit middel op de groei van de tumor in vergelijking met placebo-behandelde muizen. Met de ST88-14 MPNST cellen, kunnen muizen worden uitgevoerd gedurende 30 dagen na de enting. Op dit moment, tumoren hebben meestal uitgegroeid tot de maximale toegestane grootte van institutionele zorg en het gebruik van dieren commissies en moet worden opgeofferd. Na de laatste opnamesessie, zijn muizen gedood en monsters nodig zijn voor de verdere analyse van de resultaten van de behandeling (bijvoorbeeld bloed voor de bepaling van de bloedspiegels van de therapeutisch middel, tumorweefsel voor gewicht bepalen, onderzoek van de histologie, de bepaling van Ki67 en TUNEL etikettering indices en beoordeling van de biochemische parameters) verzameld. Precies wat exemplaren worden verzameld zal afhangen van de behoeften van de experimentele opzet. Muizen met tumoren moet dagelijks worden gecontroleerd en beëindigd als ze ziek worden (gebrek aan normale verzorging en vermijdingsgedrag), niet in staat zijn om te eten of te drinken, of als de tumor wordt overdreven groot is als de normale bewegingen van het lichaam belemmeren. Tumorlast mag niet worden toegestaan ​​om 10% van de normale van het dier het lichaamsgewicht overschrijden. Tumorgewicht als percentage van het lichaamsgewicht wordt berekend door het gewicht van de tumor dragende dieren om het gewicht van leeftijd / geslacht gematchte controle dieren. Cachexie mag niet worden toegelaten om zich klinisch significant. Gewichtsverlies bij tumor-dragende dieren mag niet meer dan 20% van het normale lichaamsgewicht. 5. Representatieve resultaten: Figuur 1 illustreert de typische progressieve verhoging van bioluminescentie waargenomen 1 tot 18 dagen na het enten in een goed gevestigde orthotope xenograft in een naakt (NIH III) muis (AC). Kwantificering van de bioluminescentie signalen waargenomen 1-24 dagen na de transplantatie blijkt dat, hoewel deze signalen geleidelijk te verhogen, groei van de tumor aanzienlijk versnelt in de latere stadia van de studie periode (figuur 1D). Te rigoureus aan te tonen dat de groei van tumoren heeft plaatsgevonden in geënt muizen, we routinematig verzamelen van de ischiadicus zenuw-en, indien blijkt dat de tumor heeft de epineurium gescheurd en viel aangrenzend weefsel, omliggende zachte weefsel en de skeletspieren. Gezien de agressieve groei van MPNSTs, is het niet verwonderlijk dat we vaak dat de geënte tumorcellen hebben de normale grenzen van de zenuw geschonden en vielen aangrenzende weefsels (figuur 1E). We hebben ook vaak dat geënt MPNST cellen agressief migreren naar zenuw proximaal en distaal van het transplantaat site. Figuur 1. Bioluminescentie beeldvorming van NIH III muis orthotopically geënt met luciferase-tag MPNST cellen 1 dag na de enting (A). Merk op dat de signalen gedetecteerd in de regio van belang (ROI) in verschillende muizen allemaal binnen een orde van grootte van elkaar. Reimaging 10 dagen (B) en 18 dagen (C) post-enten laat zien dat bioluminescente signalen geleidelijk te verhogen op het transplantaat site in afzonderlijke muizen. (D) grafiek ter illustratie van de geleidelijke stijging van de relatieve foton telt / seconde dat gedurende de ent plaats 1-24 dagen na het enten. (E) microfoto van het transplantaat site van deze muis demonstreren groei van de tumor en focale invasie in aangrenzende skeletspieren.