Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

1. Preparación de los reactivos Los reactivos que se utilizarán durante todo el experimento debe estar preparado antes de iniciar el protocolo quirúrgico. Tenga en cuenta que todas las soluciones se realizaron utilizando una técnica estéril. Solución salina fisiológica (PSS) es el mejor preparado en dos componentes: una solución de sal básica y una solución de bicarbonato de sodio. Preparar dos soluciones a la concentración de 20X y almacenar a 4 ° C. El bicarbonato de sodio a 20X es 360.0mM NaHCO3 (84.01g/mol) y la solución de sal básica en 20 veces la concentración es 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm de CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), y MgSO 4 • 7H 23.4mm 2 O (246.48g/mol). Las soluciones deben ser preparadas en dH 2 O y los productos químicos hay que añadir uno a la vez y se agita hasta que la solución es clara antes de añadir el producto químico siguiente Preparar 2L de PSS mediante la dilución de volúmenes iguales de bicarbonato de sodio y la solución de sal básica y la dilución de la concentración 1X (para dos 2L de PSS diluir 100 ml de cada solución de bicarbonato de sodio y sal básica en dH 2 O Lugar matraz aforado de 2 litros que contiene PSS PSS y en 37 ° C baño de agua. Equilibre la solución con 5% de CO 2 / gas balance de nitrógeno durante 1 hora antes de comenzar el procedimiento quirúrgico. Sustancias químicas vasoactivas (fenilefrina por ejemplo, la acetilcolina, nitroprusiato de sodio) están mejor preparados a una concentración 1M en dH2O y se almacena en 100μl alícuotas a -20 ° C. 2. Preparación de los animales Determinar el peso del ratón y administrar la dosis inicial de pentobarbital de sodio en 90mg/Kg por inyección intraperitoneal. A lo largo del procedimiento, el ratón es continuamente monitoreado para el plano de anestesia a través de una pizca dedo del pie y un examen cuidadoso de la frecuencia respiratoria. Inyecciones adicionales de pentobarbital de sodio debe ser administrado como sea necesario para mantener a 20mg/kg avión anestesia. El plano quirúrgico de anestesia se mantiene de acuerdo con las regulaciones federales e institucionales tal como se indica en el protocolo de cuidado de los animales aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo (ACUC) de la Universidad de Columbia Británica del Norte. Eliminar el vello de la zona abdominal y el flanco / cadera en máquina de afeitar. Suprimir los pelos sueltos de gasa con alcohol y palmaditas en la zona con cinta adhesiva. Esto es suficiente ya que este procedimiento experimental es terminal. Coloque el ratón sobre una tabla quirúrgica clara en posición supina y conectar el ratón a la junta con cinta adhesiva de cada pata de la mesa. La temperatura corporal se mantiene a través de una lámpara de calor externa y controlado a través de un termómetro rectal para asegurarse de que la hipotermia no ocurre como resultado de la anestesia. 3. Procedimiento Quirúrgico Durante todo el procedimiento quirúrgico garantizar tejido expuesto se mantiene siempre con una solución equilibrada superfused PSS calentado. También es importante no entrar en contacto con los vasos de interés con los instrumentos quirúrgicos o lesionar los vasos mediante la colocación de mucha fuerza en ellos mediante la manipulación de tejido adiposo y tejido conectivo alrededor de ellos. Coloque el ratón en el ámbito de disección. Hacer una incisión a lo largo de la superficie ventral de la cavidad abdominal y retraer la piel hacia la columna vertebral del ratón. Una vez que la piel se retrae de manera que la LN es fácilmente visible, el pin de la piel en un pedestal de transparencia Sylgard 184. Eliminar la capa delgada de tejido conectivo que cubre los alrededores de la LN Desactive la superposición de tejido adiposo y rodean el ganglio linfático hasta el lecho microvascular se expone. El segmento arterial principal establece junto a la LN, y que comúnmente se superpone a la vénula. La cirugía tarda aproximadamente 30 minutos. 4. Análisis de imágenes y de buques Una vez que el segmento de la flota de interés se expone bajo el microscopio de disección, asegurar la preparación en el microscopio intravital. Tenga en cuenta que los restos de animales en el tablero quirúrgico clara, mientras que en el microscopio intravital durante toda la duración del experimento. La temperatura corporal se mantiene a través de una lámpara de calor y se mide a través de un termómetro rectal como se describe en la sección de cirugía. El avión de la anestesia también se controla durante todo el experimento descrito en la sección 2.1. Configure la superfusión y las líneas de succión. Superfusión de PSS se produce por gravedad desde un depósito, en el depósito de la chaqueta de agua caliente (la camisa de agua se distribuye y se calienta por el baño de agua circulante) se perfunde en un 5% de CO 2 de nitrógeno equilibrada, y hacia abajo una línea de goteo a una velocidad de 10 ml / min. Una línea de succión debe ser utilizado para continuar tirar PSS superfused lejos de la preparación. Tenga en cuenta que antes de la prueba las líneas de succión y la camisa de agua se limpian y se almacenan después de cada experimento. Esto asegura la esterilidad antes de la siguiente experimento. Compruebe la temperatura de la PSS superfusing. Ajuste la temperatura de labaño de agua circulante y / o la tasa de superfusión PSS para alcanzar una temperatura de ~ 37 ° C a través de la preparación. Deje que el sistema vascular se equilibre con PSS por lo menos durante 60 minutos y cuantificar el diámetro del vaso con la pinza de vídeo. Por lo general, el diámetro del vaso se debe determinar en varios puntos (por ejemplo, a los 40, 50, y 60 minutos) para asegurar el buque se ha estabilizado. Evaluar la salud de los buques que utilicen un agonista del músculo liso específica (por ejemplo fenilefrina, PE) y un agonista específico del endotelio (por ejemplo la acetilcolina, ACh). Concentración de agonista se debe ajustar en función del agonista, pero para el PE y Ach, el buque debe ser evaluado en cada concentración de suma acumulativa (10-5M y 10-9M) a la superfusate. Cada aplicación de agonistas deben estar separadas por una fase de lavado (normalmente 30 minutos) con PSS hasta que el barco vuelve a un diámetro de descanso. Tras la evaluación de la salud de los vasos, con posterioridad fármacos vasoactivos, marcaje fluorescente, y la célula de seguimiento experimentos pueden llevarse a cabo. Tras el final del experimento los animales se da una sobredosis de pentobarbital sódico. El animal es luego controlada para garantizar que no hay respuesta a pellizcar los dedos y la falta de movimiento respiratorio o latido del corazón. En el momento en que esto es seguido por dislocación cervical. 5. Los resultados representativos: Tras el período de equilibrio de la preparación debe dar una imagen clara que permita la identificación tanto de las arteriolas y vénulas que los suministros de los ganglios linfáticos inguinales. Debe haber un mínimo de células adiposas que rodean los vasos para permitir las paredes de las arteriolas y vénulas que se observa claramente en las pinzas de vídeo que se superponen para calcular el diámetro del vaso. El punto esencial de una preparación exitosa es la arteriola tiene un rico suministro de sangre se mueve a través de la luz y que hay un grado significativo del tono vascular (es decir, la arteriola tiene la capacidad de vasoconstricción y vasodilatación de músculo liso y endoteliales agonistas específicos, respectivamente) . Figura 1. Imagen de microscopía intravital de alimentación linfáticos inguinal nodo arteriola (flecha roja) la alimentación de los ganglios linfáticos se equilibró con solución salina fisiológica y corriendo al lado de la vénula principal (flecha verde). Figura 2. Respuesta normal a la fenilefrina superfused vasoactivo (PE) por la suma acumulativa de solución salina fisiológica de las concentraciones de 10 -9 M a 10 -5 M. La presencia de una vasoconstricción robusta es sugerente de la función normal del músculo liso en la arteriola. Figura 3. Respuesta normal a la acetilcolina superfused vasoactivo (ACh) por adición acumulativa de solución salina fisiológica de las concentraciones de 10 -9 M a 10 -5 M. La presencia de una vasodilatación robusta sugiere normal presente la función endotelial en la arteriola.