Microscopia intravital do linfonodo inguinal

1. Preparação do Reagente Reagentes para ser usado durante todo o experimento deve ser preparado antes de iniciar o protocolo cirúrgico. Note-se que todas as soluções foram feitas utilizando técnica estéril. Solução salina fisiológica (PSS) é o melhor preparado em dois componentes: solução de sal básica e solução de bicarbonato de sódio. Prepare as duas soluções em 20X de concentração e armazenar a 4 ° C. Bicarbonato de sódio a 20X é 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) e solução de sal básica em 20X concentração é 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), e 23,4 mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). As soluções devem ser preparadas de dH 2 O e produtos químicos devem ser adicionados um de cada vez e agitado até que a solução é clara antes de adicionar o produto químico próxima Prepare 2L de PSS diluindo volumes iguais de bicarbonato de sódio e solução de sal básica e diluir para 1X concentração (por duas 2L de PSS diluir 100mL de cada solução de bicarbonato de sódio e sal básico em dH 2 O Lugar balão volumétrico de 2L contendo PSS e PSS em 37 ° C banho-maria. Equilibrar a solução com 5% de CO 2 / gás nitrogênio equilíbrio para 1hr antes do início do procedimento cirúrgico. Produtos químicos vasoativas (ex. fenilefrina, acetilcolina, nitroprussiato de sódio) são mais bem preparados na concentração de 1M em dH2O e armazenados em 100μl alíquotas a -20 ° C. 2. Preparação dos animais Determinar o peso do mouse e administrar a dose inicial de pentobarbital sódico a 90mg/kg por via intraperitoneal. Durante todo o processo o mouse é continuamente monitorado para avião anestesia via pinch dedo do pé e um exame cuidadoso da freqüência respiratória. Injeções adicionais de pentobarbital sódico deve ser administrado conforme a necessidade de 20mg/kg de manter plano de anestesia. O plano cirúrgico de anestesia é mantida de acordo com os regulamentos federais e institucionais, conforme descrito no protocolo de atendimento de animais aprovado pelo Comitê Animal Care e Use (ACUC) da Universidade do Norte do BC. Remover os pêlos da região abdominal e flanco / hip pela máquina de barbear. Remover restantes cabelo solto por gaze com álcool e acariciando a área com fita adesiva. Isto é suficiente como este procedimento experimental é terminal. Posicione o mouse em uma placa clara cirúrgica em posição supina e anexe o mouse para a placa gravando cada pata para o conselho. Temperatura corporal é mantida através de uma lâmpada de calor externo e monitorados via termômetro retal para garantir que a hipotermia não ocorre como resultado de anestésico. 3. Procedimento Cirúrgico Durante todo o procedimento cirúrgico garantir tecido exposto é sempre mantido superfused com solução equilibrada PSS aquecido. Também é importante nunca fazer o contato com a vasculatura de interesse com instrumentos cirúrgicos ou ferir os vasos, colocando a força muito sobre eles através da manipulação de tecido adiposo e tecido conjuntivo em torno deles. Posicione o mouse no âmbito de dissecação. Faça uma incisão na linha média ao longo da superfície ventral da cavidade abdominal e retrair a pele para a coluna vertebral do rato. Quando a pele é retirada para que a LN é facilmente visível, o pino da pele em um pedestal de Sylgard transparente 184. Remover a fina camada de tecido conjuntivo sobrepondo a área ao redor do LN Clara a sobreposição de tecido adiposo e cercam o nó de linfa até o leito microvascular está exposto. O principal segmento arterial estabelece adjacente ao LN e é comumente sobrepostos pela vênula. Toda a cirurgia demora cerca de 30 minutos. 4. Análise de imagem e navio Uma vez que o segmento de interesse navio está exposta no âmbito de dissecação, assegurar a preparação no microscópio intravital. Note-se que animal permanece no conselho claro cirúrgica, enquanto no microscópio intravital durante toda a duração do experimento. A temperatura corporal é mantida através de lâmpada de calor e medido através de termômetro retal, conforme descrito durante a seção cirúrgica. O avião anestesia também é monitorada durante todo o experimento como descrito na seção 2.1. Configure o superfusão e linhas de sucção. Superfusão do PSS ocorre por alimentação por gravidade a partir de um reservatório, no reservatório jaqueta de água aquecida (a jaqueta de água é distribuída e aquecida pelo banho de água circulante) de perfundidos por 5% de nitrogênio CO 2 equilibrado, e para baixo uma linha de gotejamento a uma taxa de 10ml / min. A linha de sucção deve ser usado para continuar a puxar PSS superfused longe da preparação. Note-se que antes do experimento as linhas de sucção e uma jaqueta de água são cuidadosamente limpos e armazenados após cada experimento. Isso garante a esterilidade antes do próximo experimento. Verifique a temperatura do PSS superfusing. Ajustar a temperatura docirculando banho de água e / ou a taxa de superfusão PSS para atingir uma temperatura de ~ 37 ° C em toda a preparação. Permitir a vasculatura para equilibrar com PSS para pelo menos 60 minutos e quantificar o diâmetro do vaso usando o paquímetro de vídeo. Tipicamente, o diâmetro dos vasos deve ser determinada em vários pontos (por exemplo, em 40, 50 e 60 minutos) para garantir que o navio tenha estabilizado. Avaliar a saúde do navio usando um agonista do músculo liso específica (ex. Fenilefrina, PE) e um agonista endotélio específico (ex. acetilcolina, ACh). Concentração de agonista deve ser ajustada dependendo do agonista, mas para PE e Ach o navio deve ser avaliado em cada concentração pela adição cumulativa (10-5M a 10-9M) para o superfusate. Cada aplicação agonista devem ser separados por uma fase de lavagem (normalmente 30 minutos) usando PSS, até o navio retorna ao diâmetro de descanso. Após a avaliação da saúde dos vasos, após uso de drogas vasoativas, rotulagem fluorescentes e rastreamento de células experimentos podem ser realizados. Após o final do experimento o animal recebe uma overdose de pentobarbital sódico. O animal é então monitorado para garantir que não há resposta para beliscar dedo do pé e falta de movimento respiratório ou batimentos cardíacos. Nesse momento esse é seguido por deslocamento cervical. 5. Resultados representativos: Após o período de equilíbrio a preparação deve resultar em uma imagem clara que permite a identificação de ambos os arteríola e vênula que abastece o nó de linfa inguinal. Deve haver células adiposas mínima em torno dos vasos para permitir paredes da arteríola e vênula ser claramente observado para as pinças de vídeo para ser sobreposta para calcular o diâmetro dos vasos. O ponto de integrante de uma preparação bem sucedida é a arteríola tem um rico suprimento de sangue em movimento através da luz e que há um grau significativo de tom vascular (isto é, a arteríola tem a capacidade de vasoconstrição e dilatam de músculo liso e endoteliais agonistas específicos, respectivamente) . Figura 1. Imagem de microscopia intravital de linfonodo inguinal alimentar arteríola (seta vermelha) alimentando o linfonodo equilibrada com solução salina fisiológica e correr ao lado do principal vênula (seta verde). Figura 2. Vasoativas resposta normal à fenilefrina superfused (PE) pela adição cumulativa de soro fisiológico a partir das concentrações 10 M -9 a 10 -5 M. A presença de uma vasoconstrição robusta é sugestivo de função muscular normal liso presente na arteríola. Figura 3. Vasoativas resposta normal à acetilcolina superfused (ACh) pela adição cumulativa de soro fisiológico das concentrações de 10 M -9 a 10 -5 M. A presença de uma vasodilatação robusta é sugestiva de apresentar função normal endotelial na arteríola.