Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest
Summary
Een techniek voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de lies lymfeklier (LN) is geschetst. Een dergelijke techniek maakt het mogelijk voor real-time,<em> In vivo</em> Studie van de lymfeklier microvasculatuur en structuur, zowel tijdens homeostase en infectie. Deze techniek kan worden aangepast naar cel mensenhandel studies en naar andere lymfeklieren sites.
Abstract
Lymfeklieren (LN's), verspreid over het lichaam, zijn een integraal onderdeel van het immuunsysteem. Ze dienen als een site voor inductie van adaptieve immuunrespons en dus de ontwikkeling van effector cellen. Als zodanig, LNS zijn de sleutel tot de bestrijding van binnendringende ziekteverwekkers en behoud van gezondheid. De keuze van LN om te studeren wordt bepaald door de bereikbaarheid en het gewenste model, de inguinale lymfeklier is goed gelegen en gemakkelijk ondersteunt studies van biologische relevante modellen van de huid en slijmvliezen genitale infectie.
De lies LN, net als alle LNS, beschikt over een uitgebreid netwerk van microvasculaire het leveren van het met bloed. In het algemeen is dit microvasculaire netwerk omvat de belangrijkste voedermiddelen arteriole van de LN die vervolgens takken en voedt hoog endotheliale venulen (HEV). HEV's zijn gespecialiseerd voor het vergemakkelijken van de handel van de immuuncellen in de LN tijdens zowel homeostase en infectie. Hoe HEV handel te reguleren in de LN onder beide omstandigheden is een gebied van intense exploratie. De LN-feed arteriole, heeft directe invloed op de stroomopwaarts HEV's en is de belangrijkste toevoer van voedingsstoffen en cel-rijke bloed in de LN. Verder worden veranderingen in het voer arteriole betrokken bij het faciliteren van inductie van adaptieve immuunrespons. De LN microvasculatuur heeft duidelijk belang bij het handhaven van een optimale bloedtoevoer naar de LN en reguleren immuuncellen instroom in de LN, die zijn cruciale elementen in de juiste functie LN en vervolgens immuunrespons.
De mogelijkheid om de LN microvasculatuur in-vivo-studie is de sleutel tot het ophelderen hoe het immuunsysteem en de microvasculatuur op elkaar inwerken en elkaar beïnvloeden in het LN. Hier presenteren we een methode voor in vivo beeldvorming van de lies lymfeklier. Wij richten ons op beeldvorming van de microvasculatuur van de LN, met bijzondere aandacht voor methoden die de studie van gezonde vaten, de mogelijkheid om beeldvorming van levensvatbare schepen te behouden gedurende een aantal uren, en kwantificering van het schip grootte te verzekeren. Methoden voor perfusie van de microvasculatuur met vasoactieve geneesmiddelen, alsmede de mogelijkheden op te sporen en te kwantificeren cellulaire verkeer worden ook gepresenteerd.
Intravitale microscopie van de lies LN maakt een directe beoordeling van microvasculaire functionaliteit en real-time interface van de directe interface tussen de immuuncellen, de LN, en de microcirculatie. Deze techniek potentieel om te worden gecombineerd met de vele immunologische technieken en fluorescerende cel etikettering, alsmede gemanipuleerd om vaatstelsel van andere LNS studie.
Protocol
Discussion
Intravitale microscopie van de lies lymfeklier hier gepresenteerde biedt de mogelijkheid om de afbeelding microvasculatuur van de lymfeklier in-vivo. Zo, het vergemakkelijkt een middel om directe, real-time observatie. Beeldvorming van de LN microvasculatuur is een unieke site die het mogelijk maakt een het bestuderen van de interface tussen de immuunrespons en het vaatstelsel. Met behulp van deze voorbereiding, kan richten zich specifiek gericht zijn op de immuunrespons, veranderingen in het vaatstelsel, of op interactie tussen de twee.
Zoals met alle experimentele benaderingen, standaard intravitale microscopie heeft zowel voordelen en beperkingen. Standaard IVM, zoals de voorbereiding hier beschreven, kan eenvoudig worden aangepast, en is al eerder aangetoond door de auteurs epifluorescerende microscopie mogelijk door de invoering van fluorescerende tracer kleurstoffen of geëtiketteerd celpopulaties. Hoewel standaard IVM geeft niet de mogelijkheid van driedimensionale beeldvorming en het traceren, zoals zou worden gegeven door twee-foton microscopie of angiografie, is cell tracking nog steeds bereikt in twee dimensies waardoor cel-tot-cel en cel-tot-vaatstelsel interactie te waargenomen en gekwantificeerd en in combinatie met in-vivo toediening en de daaropvolgende kleuring met fluorescerende antilichamen kunnen worden gebruikt om gegevens over eiwit / marker expressie in real-time te geven.
Met name, alternatieve beeldvormende technieken vereisen een statische omgeving voor afbeeldingen, klemmen van de chirurgische gebied of de toevoeging van een dekglaasje op een platte voorbereiding is vaak nodig. Dit beperkt, zo niet elimineert, de mogelijkheid om actief te vasculaire of andere bemiddelaars perfuseren over de voorbereiding op vasculaire integriteit en fysiologie, etc. of het gebruik van andere technieken, zoals uitgevoerd vaatverwijding proeven in de IVM voorbereiding te evalueren. Bovendien is standaard IVM niet nodig een volledig vlakke voorbereiding en wordt niet beïnvloed door beweging, zoals die gegenereerd door de ademhaling van het dier. Dit maakt standaard IVM worden gebruikt in meer chirurgische gebieden met een grotere reproduceerbaarheid. Dit wordt geïllustreerd door de lies lymfeklier voorbereiding hier beschreven. Gezien de grootte en vorm van de lymfeklieren, kan de bereiding niet worden gemaakt vlak zonder verwonden het weefsel en de locatie van het knooppunt leidt tot aanzienlijke beweging als gevolg van dierlijke ademhaling. Dergelijke kwesties zou moeilijk te overwinnen door andere methoden, maar zijn gemakkelijk te ondervangen met behulp van de standaard beschreven IVM voorbereiding.
Samengevat, kan de bereiding hierboven beschreven worden gecombineerd met een aantal andere biochemische, vasculaire en / of immunologische technieken, zoals de overdracht van subsets van geactiveerde of gelabelde cellen, inductie van hypoxie, en over-expressie van uitputting van de vasculaire mediators. Echter, aanvullende toepassingen zijn afhankelijk van de gezondheid van de eerste voorbereidingen. Daarom is het van belang om altijd te testen van de gezondheid van de bloedvaten in beeld wordt gebracht en geëvalueerd. Belangrijke punten voor het bereiken van een gezondheids-preparaat het waarborgen van de voorbereiding is voortdurend geperfuseerd met evenwicht PSS op lichaamstemperatuur en het minimaliseren van contact en stress op de chirurgische gebied tijdens de operatie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gefinancierd door de Canadese Institutes of Health Research, de Canadese Stichting voor Innovatie, Universiteit van British Columbia Centrum voor Blood onderzoek en de Universiteit van Noord-BC.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich |
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
