El uso de un sistema de suspensión de peso para la isquemia del hígado en ratones

Observaciones generales. Todas las operaciones deben llevarse a cabo bajo un microscopio vertical de disección (Leica) y utilizando un coagulador quirúrgico. Los ratones en los grupos experimentales y de simulación debe ser equiparado en edad y peso para asegurar la comparabilidad de los resultados. La administración de la temperatura, la presión arterial, la anestesia y el líquido debe ser estable y controlado durante todo el experimento. 1. Anestesia y Cirugía Ratones C57BL / 6 debe estar dentro de un rango de edad de 10 a 16 semanas y debe ser acompañado de género en los grupos respectivos. Anestesie ratones con pentobarbital sódico (70 mg / kg de peso corporal ip) y mantener la anestesia con aprox. 10 mg / kg / h pentobarbital sódico. La sobredosis puede reducir significativamente la presión arterial y por lo tanto puede alterar los resultados. Los ratones, colóquelas sobre una mesa calentada a temperatura controlada (temperatura ambiente, Effenberg, Munich, Alemania) con un termómetro rectal, unida a una reacción térmicacontrolador para mantener la temperatura corporal a 37 º C. Los ratones y colóquelos en una posición supina sobre la mesa de cirugía, con las extremidades superiores e inferiores unidas a la mesa con cinta extraíble. En el caso de los experimentos de supervivencia de técnicas adecuadas de asepsia, incluyendo el recorte de cabello, la desinfección de la piel con los yodóforos (Betadine, por ejemplo), la manipulación estéril de instrumentos esterilizados en autoclave, y usando máscaras de unos guantes estériles para el cirujano son obligatorios. 2. La oclusión de la tríada portal Cubra el área de la incisión con aceite mineral para evitar la inhalación de pelo de ratón por el corte de la piel y previniendo así el riesgo de alergias del pelo del ratón. Realizar laparotomía media y la incisión de la línea alba hasta el extremo superior de modo que usted puede exponer el hígado. Si es posible realizar la incisión con un electrodo de coagulación (Erbe, ICC50, Tuebingen, Alemania) para prevenir el sangrado. Coloque la tabla de calefacción con el ratón en una posición que la cola es de direcciónTed para el cirujano. Esa posición te ofrece la mejor configuración para la localización de la tríada y colocar la sutura. Desplazar el intestino en el lado derecho utilizando un hisopo de algodón húmedo para exponer la punta de la tríada portal. Un poco cambiar el lóbulo medio e izquierdo hacia el diafragma y el lóbulo derecho hacia el intestino. Eso le dará una visión clara de la tríada portal por encima de la bifurcación de la derecha, mediana / izquierda lóbulos. Inspeccione cuidadosamente la tríada portal y sostenga el lóbulo derecho suavemente con unas pinzas suaves. Eso le dará una bonita vista de la tríada portal de la izquierda. Una vez identificado visualmente a colocar la aguja con el hilo de sutura (sutura de 7/0 nylon; Ethicon, Norderstedt, Alemania) a través de un soporte de la aguja en el lado izquierdo tríada portal, incluyendo la arteria hepática, la vena hepática, y el conducto biliar de la izquierda a la derecha del ratón. La puntada tiene que estar estrechamente con la tríada. Un punto más profundo puede lesionar la vena vaca inferior que se encuentra bajola tríada. Por lo tanto mantener los lóbulos hepáticos derecho hacia abajo con las pinzas para identificar la vena cava antes de colocar la puntada. Tome la punta de la aguja en el lado derecho con una pinza y tire suavemente de la zona del hígado, sin lesionar el hígado. Adjunte a cada extremo de la sutura un tubo Eppendorf (aproximadamente 3 g, llena de agua) y colocar ambos extremos de sutura sobre los titulares de sutura. Coloque el soporte de sutura distal de la puntada para que la sutura no interfiere con la tríada derecha. Mediante la aplicación de las ponderaciones de la tríada será inmediatamente obstruida, provocando la interrupción del suministro de sangre a los lóbulos izquierdo y la mediana del hígado. El éxito de la oclusión puede ser fácilmente confirmado por la inspección visual de la palidez pálido de los lóbulos isquémicos. En contraste, el cambio de color desaparece inmediatamente cuando los pesos colgantes son liberados de los polos y el hígado se reperfundido. Este modelo de isquemia parcial hepática mesentérica evita la congestión mediante la preservación de Blood flujo de los lóbulos hepáticos derecho. Vuelva a colocar el intestino en la cavidad abdominal. Mantener el hígado y el intestino tibia con una esponja húmeda empapada con agua a 37.0 ° C. Además de mantener una temperatura corporal estable de cubrir los ratones con una envoltura de los alimentos disponibles en el mercado después de terminar la cirugía. Realizar la isquemia como se requiere según el protocolo experimental. Después de un comunicado de la isquemia de tiempo definido los pesos y la reperfusión de los lóbulos del hígado la mediana y la izquierda se iniciará inmediatamente. Esta técnica permite la producción de isquemia reversible en ratones. Si no hay tiempos de isquemia más se llevará a cabo retirar con cuidado el hilo de sutura. Añadir aproximadamente 400 l de cloruro sódico en la cavidad abdominal 15 minutos antes y directamente después de la reperfusión. Continuar para sustituir el líquido cada 30 minutos en una cantidad de 100 l para compensar la pérdida de fluido durante el tiempo de reperfusión. Para los experimentos de supervivencia de la herida quirúrgica se cierra con sutura continua de la pared muscular y wi pielª una sutura 4/0. 3. Los cambios en la perfusión del hígado Los parámetros de resultados se recomienda lo siguiente para determinar isquemia hepática daño hepático siguiente: Determinar las enzimas hepáticas (por ejemplo, ALT, AST) y la histología hepática (tinción H & E) isquemia hepática siguiente y reperfusión 3,9. Figura 1 Modelo de un sistema de suspensión-el peso de la isquemia hepática. Un sistema de peso que cuelga se ha establecido para inducir isquemia hepática del lóbulo izquierdo y la mediana de tres. (A) Por lo tanto el lóbulo caudado y el derecho se separaron suavemente del lóbulo izquierdo. El lóbulo derecho estaba ligeramente desplazado a continuación para ver con claridad la tríada portal encima de la bifurcación de los lóbulos derecho e izquierdo, la mediana. Una sutura de nylon 8,0 se colocó bajo la tríada hepática izquierda. (B) al final de cada sutura un peso pequeño (3 g Eppendorf tuBES llenos de agua) se adjunta y aplicada. Isquemia hepática es visible por un cambio de color del lóbulo izquierdo y la mediana de rojo a amarillo pálido. Este diseño experimental permite la oclusión precisa y reperfusión de la tríada hepática izquierda por la aplicación y liberación de la carga de peso. Figura 2. Efecto de diferentes tiempos de isquemia en el hígado alanina (ALT) y aspartato (AST) aminotransferasa en ratones. Parcial portal de la isquemia se indujo la tríada como se indica (0 – 60 min de isquemia). Después de 2 h de la reperfusión, ALT (A) y AST (B) se midieron. Los resultados se expresan como media ± SE de 6 a 7 ratones / grupo. * P <0,05 en comparación con isquemia min 0 (control simulado).