A estratégia para identificar mutações de novo em Distúrbios comuns, tais como autismo e esquizofrenia

1. Seleção de doença que pode ser causada por mutações de novo Uma doença que corresponde aos seguintes critérios podem se encaixar com a hipótese de mutação de novo: A aptidão reprodutiva é reduzida. A freqüência da doença é relativamente alta e constante, apesar amplamente variados ambientes. A doença é associada a um maior idade paterna. A ligação clássico e estudos de associação não conseguiu explicar uma fração significativa da hereditariedade da doença. Os dados com gêmeos de apoiar um modelo novo. Análise da probabilidade de que uma doença comum, onde as mutações de novo pode em parte explicar a base genética é um primeiro passo crítico. 2. Seleção de casos e amostras de DNA Seleção de amostras adequadas é fundamental para o sucesso da identificação de mutações de novo. Para maximizar a chance de encontrar mutações de novo, nós recomendamos o seguinte: Selecionar os casos com idade precoce de início fenótipo, grave, com pais não afetados, pais mais velhos e sem história familiar da doença prolongada. Escolha pacientes cujos DNAs disponíveis são suficientes para conduzir o estudo. Especialmente crítico é a disponibilidade de DNA a partir de uma fonte de células primárias que não foi submetido a cultura (por exemplo, DNA de sangue ou saliva DNA), A disponibilidade de ambos os pais DNA é fundamental para determinar o status de transmissão mutação (vs herdou de novo). Disponibilidade de novos grupos afetados e controles normais é necessário para os estudos de validação genética uma vez que genes candidatos são identificados. Estimar o tamanho da amostra com base na taxa de mutações, a quantidade de genes para ser exibido ea estimativa da fração de casos que podem resultar de uma mutação de novo. 3. Gene resequencing; duas abordagens principais Alta qualidade seqüenciamento baixa taxa de transferência Esta abordagem é baseada em genes as abordagens candidato. Seleção de genes candidatos (s) Selecionar o melhor candidato genes com base em um sistema de pontuação que é construído em 6 critérios principais. Em seguida, calcular o total que correspondia à soma de todos os pontos atribuídos usando os seis critérios relacionados na Tabela 1. Veja o exemplo do nosso projeto na figura 1 do selecionado e não selecionado distribuição genes. Tabela 1. Critérios utilizados para a seleção de genes candidatos Figura 1. Gráfico mostrando a distribuição dos genes selecionados e não selecionados para o seqüenciamento em nosso projeto. Obtivemos uma distribuição de genes classificados por propriedades candidato por genes de classificação de acordo com seu valor de pontuação. Por exemplo, SHANK3 e NRXN1 genes, dois genes que encontramos mutação de novo, teve uma pontuação de 7 e 6 respectivamente (o máximo é 12). Primers projeto usando software Primers3 através Exonprimer. Apenas codificação região e junção de emenda devem ser cobertos, incluindo um extra de 50 pares de base em cada lado do exon. Condições de otimizar o PCR para a escolha de Taq, volume de reação, etc Otimizar todos os fragmentos de PCR Amplificar 5 ng de DNA genômico extraído de amostras de sangue de acordo com procedimentos padrão Antes de enviar para o seqüenciamento, fazer controle de qualidade de seus produtos PCR carregando um gel de agarose 2%. Selecionados aleatoriamente amostras. A seqüência de produtos de PCR em um analisador de DNA em uma fita. Um fragmento é considerado sucesso seqüenciado se a análise de mais de 90% dos traços é possível. Isto é aplicável para uma exibição em grande escala. Detecção de variantes Use ferramentas para detecção e genotipagem das variações genômicas, tais como PolyPhred, Polyscan Surveyor e Mutação. Uma combinação de mais de 2 ferramentas de detecção é o ideal. Por exemplo, PolyPhred v.5 e v.6 PolyPhred com as configurações padrão não detectam as mesmas variações. Polyscan v.3 tem uma taxa de mutação mais elevada de falsos positivos de SNPs (96%) e menos para o indels (93%). PolyPhred v.6 não detectou a maioria das indels verdade, mas tem uma taxa de mutação de falsos positivos (para indels) inferior Polyscan total v.3 (90%). Devemos remover a opção de detecção de SNPs Polyscan v.3 e manter os dois PolyPhred v.5 e v.6 PolyPhred para a detecção da variante. Surveyor mutação e Polyscan são melhores para detectar indels. Nota: A opção de detecção de SNP não deve ser aplicado quando se utiliza Polyscan. Apenas o "INDEL" opção deve estar ligado. Polyscan gerado a muitos falsos positivos para a detecção de SNP. Para cada variantes exônico único romance detectado, confirmá-la manualmente por reamplifying fragmento e resequúnicos que experimentam o probando e ambos os pais usando primers reverse e encaminhar para eliminar qualquer artefato técnico. Todo exome seqüenciamento Esta abordagem é um seqüenciamento de alto rendimento visando a maioria das regiões codificantes do genoma humano. Estamos agora a utilizar esta nova abordagem no nosso laboratório, acelerando a detecção de genes candidatos em potencial. Fim do "SureSelect Exon Todos os Humanos" alvo a região de codificação de mais de 16 mil genes (50 MB do genoma) desenhado por Agilent ou qualquer outro produto similar por outros como Roche. Antes de encomendar o kit de captura, as plataformas de seqüenciamento deve ser determinar (Illumina vs sólido). Fazer a captura de acordo com o protocolo Agilent Seqüência o produto em sua respectiva plataforma da próxima geração disponível Detecção de variantes a partir do seqüenciamento exome todo: Várias ferramentas de bioinformática para detecção e genotipagem das variações genômicas a partir da plataforma de sequenciamento de última geração estão disponíveis, tais como BWA, Bfast, Bioscope que irão realizar as alinhamento. Após o qual livremente disponíveis ferramentas adicionais a jusante (por exemplo SAM ferramentas, Varscan, Annovar) seriam necessárias para chamar e anotar as variantes. Software comercial que integra o alinhamento de seqüência e chamando variante e anotação também estão disponíveis, tais como, NextGen (Softgenetics), Bio CLC, e outros 4. Priorização de variantes genômicas Variantes identificadas são então priorizados para acompanhamento de acordo com sua probabilidade de ser de novo e deletério à proteína ou mRNA função e / ou estrutura. A variante de acompanhamento para a detecção de prioridades de novo variante deve ser como segue: Variações exclusivas (observado uma vez em um único caso) Variações não está presente nos pais Proteína-truncando variações: nonsense, frameshift indels levando a mutações e emendas. Variação missense e silencioso previsto para ser funcionalmente perturbador (por exemplo, afetam splicing do mRNA). Use SIFT Polyphen e PANTHER para efeito de previsão funcionais na proteína. Se estiver usando seqüenciamento exome todo, a seleção de genes candidatos pode ser usado como uma estratégia para priorizar variantes para estudos adicionais. 5. Validação genética Resequence o gene inteiro em casos de pacientes adicionais (para identificar outras mutações causais) e nos controles. As amostras de controle serão utilizados para avaliar as freqüências alélicas das variantes priorizados. Qualquer gene que contém pelo menos duas diferentes mutações de novo deletérios (splicing nonsense, quadro de leitura, e previu missense prejudiciais) encontrada em pacientes diferentes (mas não em amostras de controlo ou de bases de dados públicas) deve ser altamente priorizadas para estudos de validação adicional. Isto inclui: um teste) para um defeito de splicing potencial em linhagens de células linfoblastóides derivado do paciente. Em nossa experiência, a maioria dos genes rendimento RT-PCR produtos de linhas celulares linfoblastóides, 2) investigar o nível de expressão alterada de proteínas através da análise quantitativa blot ocidental de extratos protéicos das linhas de células linfoblastóides e 3) ensaio da mutação / gene ao nível funcional em animal (c elegans, Zebrafish) e modelos de celulares de linha como feito anteriormente por nosso grupo (ex: 5,6). 6. Resultados representativos: Na sequência deste protocolo, que foram capazes de identificar novos genes para a esquizofrenia e autismo. Um exemplo é a nossa descoberta do gene recentemente SHANK3 (Figura 2). Duas diferentes mutações de novo no gene SHANK3, uma mutação nonsense encontradas em três irmão afetado e uma mutação missense em uma fêmea afetada. Figura 2. (A) A segregação da mutação nonsense R1117X em três irmãos afetados da família PED 419. O probando é indicado pela seta. (B) segregação da mutação missense R536W no probando, mas não seu irmão não afetado no PED 56.