Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

1. Auswahl der Krankheit, die durch de novo-Mutationen verursacht werden Eine Krankheit, die den folgenden Kriterien entspricht, kann mit der De-novo-Mutation Hypothese passen: Die reproduktive Fitness reduziert. Die Häufigkeit der Erkrankung ist relativ hoch und konstant trotz unterschiedlichster Umgebungen. Die Krankheit ist mit einem höheren Alter des Vaters verbunden. Die klassische Verknüpfung und Assoziationsstudien konnte ein signifikanter Anteil der Krankheit Erblichkeit zu erklären. Die beiden Konkordanz Daten unterstützen eine de novo-Modell. Die Analyse der Wahrscheinlichkeit, dass eine häufige Erkrankung, wo de novo Mutationen zum Teil erklären, kann die genetische Basis ein entscheidender erster Schritt ist. 2. Die Auswahl der Fälle und DNA-Proben Auswahl geeigneter Proben ist entscheidend für den Erfolg der Identifizierung von de novo-Mutationen. Zur Maximierung der Wahrscheinlichkeit des Findens de novo Mutationen, empfehlen wir folgendes: Wählen Fällen mit frühem Erkrankungsalter, schweren Phänotyp, mit gesunden Eltern, ältere Väter und ohne Großfamilie Geschichte der Krankheit. Wählen Sie Patienten, deren verfügbar DNAs sind ausreichend, um die Durchführung der Studie. Besonders kritisch ist die Verfügbarkeit von DNA aus einer Primär-Zelle Quelle, die nicht zur Kultivierung unterzogen wurde (z. B. Blut oder Speichel DNA DNA), Die Verfügbarkeit beider Eltern DNA ist von entscheidender Bedeutung, um die Mutation Übertragungsstatus (geerbt vs de novo) zu bestimmen. Die Verfügbarkeit von zusätzlichen betroffenen Kohorten und normalen Kontrollen notwendig ist für die genetische Validierungsstudien einmal Kandidatengene identifiziert werden. Schätzen Sie die Stichprobengröße auf die Mutationen Rate, die Höhe von Genen untersucht werden und die Schätzung der Anteil der Fälle, die von einer De-novo-Mutation führen kann basieren. 3. Gene Resequenzierung; zwei wichtige Ansätze Hohe Qualität mit geringem Durchsatz-Sequenzierung Dieser Ansatz basiert auf der Kandidatengene Ansätzen. Auswahl der Kandidaten-Gen (e) Wählen Sie den besten Kandidaten-Gene auf einem Scoring-System, das auf 6 wichtigsten Kriterien gebaut beruht. Dann berechnen Sie die Summe, die der Summe aller Punkte zugeschrieben Mit den sechs Kriterien, die in Tabelle 1 aufgeführten entsprach. Siehe Beispiel aus unserem Projekt in Abbildung 1 gewählten und nicht gewählten Gene Verteilung. Tabelle 1. Kriterien für die Kandidaten-Gen Auswahl verwendet Abbildung 1. Graph zeigt die Verteilung der gewählten und nicht gewählten Gene für die Sequenzierung in unserem Projekt. Wir erhalten eine Verteilung von Genen durch Kandidaten Eigenschaften von Sortier-Gene rangiert nach ihrem Score-Wert. Zum Beispiel hatte SHANK3 und NRXN1 Gene, zwei Gene, die wir gefunden de novo-Mutation, ein Score 7 bzw. 6 (Maximum ist 12). Design-Primer mit Primers3 Software durch Exonprimer. Nur kodierende Region und Spleiß-Kreuzung sollte auch eine zusätzliche 50 Basenpaare auf jeder Seite des Exon abgedeckt werden. Optimieren PCR-Bedingungen für die Wahl des Taq, Reaktionsvolumen, etc. Optimieren Sie alle PCR-Fragmente Amplify 5 ng genomischer DNA aus Blutproben nach Standardverfahren extrahiert Vor dem Senden für die Sequenzierung, tun Qualitätskontrolle Ihrer PCR-Produkte durch das Laden einer 2% igen Agarosegel. Nach dem Zufallsprinzip ausgewählt Proben. Sequence der PCR-Produkte auf einem DNA-Analyzer auf einem Strang. Ein Fragment wird als erfolgreich sequenziert, wenn die Analyse von über 90% der Spuren ist möglich. Dies gilt für eine große angelegte Screening. Varianten-Erkennung Verwenden Sie die Werkzeuge für die Detektion und Genotypisierung der genomischen Variationen wie PolyPhred, PolyScan und Mutation Surveyor. Eine Kombination von mehr als 2-Erkennungs-Tools ist ideal. Zum Beispiel, PolyPhred v.5 und PolyPhred v.6 mit den Standardeinstellungen nicht erkennen die gleichen Variationen. PolyScan v.3 hat eine höhere falsch-positive Mutationsrate für SNPs (96%) und weniger für die Indels (93%). PolyPhred v.6 nicht die Mehrheit der wahre Indels erkannt, sondern haben eine falsche positive Mutationsrate (für Indels) niedriger als PolyScan v.3 insgesamt (90%). Wir sollten uns entfernen Sie die Möglichkeit, SNPs Erkennung für PolyScan v.3 und halten beide PolyPhred v.5 und PolyPhred v.6 für Variante Erkennung. Mutation Surveyor und PolyScan sind besser zum Nachweis von indels. Hinweis: Die Option der SNP-Nachweis sollte nicht angewendet werden, wenn mit PolyScan werden. Nur die "indel" Option sollte eingeschaltet sein. PolyScan zu viele falsch positive für SNP-Detektion erzeugt. Für jeden eindeutigen Roman exonische Varianten erkannt, bestätigen Sie es manuell durch Reamplifikation des Fragments und resequGeoreferenzierung Probanden und beide Eltern mit Reverse-und Forward-Primer, um technische Artefakte zu eliminieren. Whole Exom Sequenzierung Dieser Ansatz ist ein Hochdurchsatz-Sequenzierung Targeting die Mehrheit der kodierenden Regionen des menschlichen Genoms. Wir sind jetzt gerade mit diesem neuen Ansatz in unserem Labor, die Beschleunigung der Erkennung von potenziellen Kandidaten-Gene. Bestelle das "SureSelect Menschliches Exon" targeting den kodierenden Bereich von über 16.000 Genen (50 MB des Genoms) von Agilent oder andere ähnliche Produkte von anderen wie Roche entwickelt. Vor der Aufnahme-Kit bestellen, sollten die Sequenzier-Plattformen zu bestimmen (Illumina vs SOLiD). Haben die Aufnahme nach dem Agilent-Protokoll Sequence das Produkt auf dem jeweils verfügbaren Plattform der nächsten Generation Variant-Detektion aus der ganzen Exom Sequenzierung: Mehrere Werkzeuge der Bioinformatik für die Detektion und Genotypisierung von genomischer Abweichungen von der nächsten Generation Sequencing-Plattform zur Verfügung, wie BWA, Bfast, Bioscope, die die Ausrichtung durchführen wird. Nach der zusätzliche frei verfügbare Downstream-Tools (z. B. SAM-Tools, Varscan, Annovar) wäre nötig es zu nennen und kommentieren Sie die Varianten werden. Kommerzielle Software, die Sequenz-Alignment und die Variante aufrufen und Annotation integriert sind ebenfalls erhältlich wie NextGEN (Softgenetics), CLC Bio, und andere 4. Genomic Varianten Priorisierung Identifizierte Varianten werden dann für eine Nachuntersuchung nach ihrer Wahrscheinlichkeit in sein de novo und schädlich für die Protein-oder mRNA-Funktion und / oder Struktur priorisiert. Die Variante folgen Prioritäten für den Nachweis von de novo-Variante sein sollte wie folgt: Einzigartige Varianten (einmal in einem einzigen Fall beobachtet) Variationen nicht bei den Eltern Protein-Abschneiden Variationen: Unsinn, indels was zu Frameshift und Spleißen Mutationen. Missense und stille Variation vorausgesagt werden funktionell störende (zB Auswirkungen auf mRNA-Spleißen). Verwenden Sie PolyPhen, SIFT und PANTHER für die funktionelle Prognose Wirkung auf das Protein. Wenn Sie ganze Exom Sequenzierung kann die Auswahl von Kandidatengenen als eine Strategie für die Priorisierung von Varianten zur weiteren Untersuchung verwendet werden. 5. Genetische Validierung Resequence das gesamte Gen in weitere Patientenfälle (zu anderen ursächlichen Mutationen zu identifizieren) und bei den Kontrollen. Die Kontrollproben werden verwendet, um Allelfrequenzen von priorisierten Varianten zu bewerten. Jedes Gen enthält mindestens zwei verschiedene de novo schädlichen Mutationen (Unsinn, Spleißen, Rasterverschiebungen und vorhergesagt beschädigen Missense) in verschiedenen Patienten (aber nicht in Kontrollproben oder öffentlichen Datenbanken) gefunden werden sollte hoch für weitere Validierungsstudien priorisiert werden. Dazu gehören: 1) Prüfung für einen möglichen Defekt in Spleißen lymphoblastoiden Zelllinien vom Patienten abgeleitet. Nach unserer Erfahrung ergeben die meisten Gene RT-PCR-Produkte von lymphoblastoiden Zelllinien, 2) zu untersuchen verändertes Protein Expression durch quantitative Western-Blot-Analyse von Protein-Extrakten aus der lymphoblastoiden Zelllinien und 3) weitere Prüfung der Mutation / Gen auf funktionaler Ebene in Tier (c elegans, Zebrafisch) und Zell-Linie Modelle wie zuvor von unserer Gruppe (ex: 5,6) durchgeführt. 6. Repräsentative Ergebnisse: Nach diesem Protokoll konnten wir neue Gene für Schizophrenie und Autismus zu identifizieren. Ein Beispiel ist unser kürzlich SHANK3 Entdeckung von Genen (Abbildung 2). Zwei verschiedene de novo Mutationen im Gen SHANK3, eine Nonsense-Mutation in drei betroffenen Bruder und eine Missense-Mutation in einem betroffenen Weibchen gefunden. Abbildung 2. (A) Segregation der R1117X Nonsense-Mutation in drei betroffenen Brüdern der Familie PED 419. Der Proband wird durch den Pfeil angedeutet. (B) Segregation der R536W Missense-Mutation in der Proband aber nicht ihre nicht betroffenen Bruder in PED 56.