Une stratégie pour identifier des mutations de novo dans les troubles courants comme l'autisme et la schizophrénie

1. Sélection de la maladie qui peut être causée par des mutations de novo Une maladie qui correspond aux critères suivants peuvent tenir à l'hypothèse de mutations de novo: L'aptitude à la reproduction est réduite. La fréquence de la maladie est relativement élevée et constante malgré des environnements très variés. La maladie est associée à un âge plus élevé paternelle. Le lien classique et les études d'association a omis d'expliquer une fraction significative de l'héritabilité de la maladie. Les données de concordance jumelles soutenir un modèle de novo. Analyse de la probabilité qu'une maladie commune où des mutations de novo peut expliquer en partie la base génétique est une première étape essentielle. 2. Sélection des cas et des échantillons d'ADN Sélection des échantillons appropriés est essentiel pour la réussite de l'identification de mutations de novo. Pour maximiser les chances de trouver des mutations de novo, nous recommandons ce qui suit: Sélectionnez cas avec l'âge précoce de survenue, le phénotype sévère, avec des parents non, pères plus âgés et sans antécédents de la famille élargie de la maladie. Choisissez les patients dont les ADN disponibles sont suffisantes pour mener l'étude. Surtout crucial est la disponibilité de l'ADN provenant d'une source de cellules primaires qui n'a pas été soumis à la culture (ADN par exemple du sang ou d'ADN de salive), La disponibilité des deux parents, l'ADN est essentielle afin de déterminer l'état de la transmission de mutation (héritée vs de novo). Disponibilité des cohortes supplémentaires affectés et des témoins normaux est nécessaire pour les études de validation génétique fois les gènes candidats sont identifiés. Estimer la taille de l'échantillon sur la base des taux de mutations, la quantité de gènes à être projeté et l'estimation de la fraction des cas qui peuvent résulter d'une mutation de novo. 3. Gene reséquençage; deux grandes approches Séquençage à haute qualité à faible Cette approche est basée sur des gènes candidats les approches. Sélection du gène candidat (s) Sélectionnez les meilleurs gènes candidat basé sur un système de notation qui est construit sur six critères principaux. Calculez ensuite le total qui correspondait à la somme de tous les points attribués à l'aide des six critères énumérés dans le tableau 1. Voir un exemple de notre projet dans la figure 1 de la distribution des gènes sélectionnés et non sélectionnés. Tableau 1 Critères. Utilisé pour la sélection de gènes candidats Figure 1. Graphique montrant la répartition des gènes sélectionnés et non sélectionnés pour le séquençage de notre projet. Nous avons obtenu une distribution des gènes classés par propriétés candidat par les gènes de tri en fonction de leur valeur de score. Par exemple, SHANK3 et NRXN1 gènes, deux gènes que nous avons trouvé une mutation de novo, avaient un score de 7 et 6 respectivement (maximum 12). Amorces de conception en utilisant le logiciel Primers3 travers Exonprimer. Seule la région codante et jonction d'épissage devraient être couverts, y compris un supplément de 50 paires de base de chaque côté de l'exon. Optimiser les conditions de PCR pour le choix de Taq, le volume de réaction, etc Optimiser tous les fragments de PCR Amplifier 5 ng d'ADN génomique extrait à partir d'échantillons de sang selon des procédures standard Avant d'envoyer pour le séquençage, ne contrôle qualité de vos produits de PCR en chargeant un de 2% gel d'agarose. Échantillons choisis au hasard. Séquence des produits de PCR sur un analyseur d'ADN sur un brin. Un fragment est considéré comme réussi le séquençage si l'analyse de plus de 90% de la trace est possible. Ceci est applicable pour un criblage à grande échelle. Détection Variantes Utiliser des outils pour la détection et le génotypage des variations génomiques telles que PolyPhred, Polyscan et Mutation Surveyor. Une combinaison de plus de 2 outils de détection est idéal. Par exemple, PolyPhred v.5 et PolyPhred v.6 avec les paramètres par défaut ne détectent pas les mêmes variations. V.3 Polyscan a un taux de mutation plus élevé de faux positifs pour le SNP (96%) et moins pour les indels (93%). PolyPhred v.6 n'a pas détecté la majorité des indels vrai, mais ont un taux de mutation faux positifs (pour indels) inférieur Polyscan globale v.3 (90%). Nous devons supprimer l'option de détection de SNPs pour v.3 Polyscan et garder les deux PolyPhred v.5 et PolyPhred v.6 pour la détection des variants. Mutation Surveyor et Polyscan sont meilleurs pour détecter les indels. Remarque: L'option de détection de SNP ne doit pas être appliquée lors de l'utilisation Polyscan. Seul le "Indel" option doit être activée. Polyscan généré de nombreux faux positifs pour la détection de SNP. Pour chaque roman de variantes uniques exonique détecté, il confirme manuellement en reamplifying le fragment et resequencing la proposante et les deux parents en utilisant des amorces marche avant et arrière pour éliminer tout artefact technique. Whole exome séquençage Cette approche est un séquençage à haut débit ciblant la majorité des régions codantes du génome humain. Nous sommes maintenant utilisent actuellement cette nouvelle approche dans notre laboratoire, ce qui accélère la détection des gènes candidats potentiels. Commandez "SureSelect homme Tous Exon» ciblant la région codante de plus de 16 000 gènes (50 Mo du génome), conçu par Agilent ou tout autre produit similaire par les autres comme Roche. Avant de commander le kit de capture, les plates-formes de séquençage devrait être de déterminer (Illumina vs solide). Ne la capture selon le protocole d'Agilent Séquence du produit sur votre respectives disponibles la prochaine génération de plate-forme de Variante de détection à partir du séquençage toute exome: Plusieurs outils bioinformatiques pour la détection et le génotypage des variations génomiques de la plate-forme de séquençage nouvelle génération sont disponibles telles que BWA, Bfast, le Bioscope qui effectuera l'alignement. Après quoi supplémentaires librement disponibles des outils aval (par exemple SAM outils, Varscan, Annovar) serait nécessaire, il appeler et d'annoter les variantes. Les logiciels commerciaux qui intègre l'alignement de séquences et d'appeler la variante et l'annotation sont également disponibles tels que, NextGen (Softgenetics), CLC bio, et d'autres 4. Genomic hiérarchisation variantes Variantes identifiées sont alors prioritaires pour le suivi en fonction de leur probabilité d'être de novo et délétère pour la fonction des protéines ou de l'ARNm et / ou de la structure. La variante de suivi des priorités pour la détection de novo variante doivent être comme suit: Variations uniques (observée une fois dans un seul cas) Variations pas présente chez les parents Protéine-tronquant variations: un non-sens, indels menant à frameshift et des mutations d'épissage. Variation de faux-sens et silencieux prévu pour être fonctionnellement perturbateurs (par exemple, affectent épissage de l'ARNm). Utilisez Polyphen, EIPD et PANTHER pour un effet de prédiction fonctionnelle de la protéine. Si vous utilisez séquençage exome ensemble, la sélection de gènes candidats peut être utilisé comme une stratégie pour prioriser variantes pour étude complémentaire. 5. Validation génétique Reséquencer l'ensemble du gène dans le cas de patients supplémentaires (pour identifier d'autres mutations causales) et dans les contrôles. Les échantillons de contrôle seront utilisés pour évaluer les fréquences alléliques des variantes priorité. Tout gène contenant au moins deux différentes mutations de novo délétères (non-sens, l'épissage, des déphasages, et prédit faux-sens dommageables) a constaté chez des patients différents (mais pas dans les échantillons de contrôle ou de bases de données publiques) doivent être hautement prioritaires pour les études de validation. Cela comprend: 1) Les essais pour un défaut d'épissage potentiels dans des lignées cellulaires lymphoblastoïdes dérivées du patient. Dans notre expérience, la plupart des gènes de rendement produits RT-PCR à partir des lignées cellulaires lymphoblastoïdes, 2) étudier l'expression des protéines modifiées niveaux par analyse quantitative blot Western d'extraits protéiques des lignées de cellules lymphoblastoïdes et 3) autre test de la mutation / gène au niveau fonctionnel animale (c elegans, poisson zèbre) et des modèles lignée cellulaire comme précédemment par notre groupe (ex: 5,6). 6. Les résultats représentatifs: Suite à ce protocole, nous avons été en mesure d'identifier de nouveaux gènes de la schizophrénie et l'autisme. Un exemple est notre récente découverte du gène SHANK3 (figure 2). Deux différentes mutations de novo dans SHANK3 gène, une mutation non-sens dans trois frère touchée et une mutation faux-sens dans une femme touchée. Figure 2. (A) la séparation de la mutation non-sens R1117X de trois frères de la famille affectée PED 419. Le propositus est indiquée par la flèche. (B) la ségrégation de la mutation faux-sens R536W dans le propositus, mais pas sa non-affectés frère dans PED 56.