Het gebruik van een Opknoping Weight System voor Coronary Artery Occlusion in Muizen

Algemene opmerkingen: Alle handelingen moeten worden uitgevoerd onder een rechtop dissectiemicroscoop (Olympus, SZX10 met Z-Axis Crank Post met STU2 StandBoom voet) en het gebruik van een chirurgische coagulator. Ventilatie is van cruciaal belang voor de procedure en dus een bepaalde hoeveelheid tijd moet worden besteed aan de keuze van de ventilator en het optimaliseren van de ventilatie techniek. Temperatuur, bloeddruk en anesthesie moet stabiel zijn in de hele. 1. Anesthesie, intubatie en Monitoring Gebruik C57BL / 6 muizen die ten minste 10 weken oud. Veroorzaken anesthesie met behulp van natriumpentobarbital bij een dosering van 70 mg / kg lichaamsgewicht ip Behoud anesthesie met ongeveer 10 mg / kg / h natriumpentobarbital. Wees voorzichtig met een overdosis aangezien dit beduidend lager de bloeddruk. Re-dosering van fenobarbital – ook na uur-kan leiden tot ernstige verhoging van de plasmaspiegels. Op basis van een sterk bewijs ten aanzien van isofluraan als cardioprotectief compound adviseren wij het ​​gebruik van de 'inert' en gevestigde pentobarbital in een model voor myocardischemie 46-56. Plaats muizen op een temperatuur-gecontroleerde verwarmde tafel (RT, Effenberg, München, Duitsland) met een rectale thermometer probe aan thermische feedback controller om de lichaamstemperatuur te handhaven op 37 ° C. Na de anesthesie-inductie veilig muizen in een liggende positie, met de bovenste en onderste ledematen aan de tafel met behulp van een tape en een hechting vastgemaakt aan de enkels. Doe hetzelfde voor het hoofd met behulp van de tanden. Een voldoende straatverbod is belangrijk voor een succesvolle intubatie en goed gecontroleerde chirurgie. Voorafgaand aan de operatie, dekking van de muis met minerale olie om het risico van de muis haar allergie te verminderen. Chirurgisch Expose de luchtpijp en het uitvoeren van een tracheale intubatie met behulp van bluntpolyethylene canules (Insyte 22 g, Beckton Dickinson, USA). U moet de naald stomp te kunnen gebruiken als een stilet. Trek de tong met behulp van een tang en dan duw in een hoek van 15 graden naar het lichaam. Zelfs na blootstelling van de luchtpijp en het gebruik van een microscoop, kan dit vereist wat training. Wees ervan bewust dat een kleine beschadiging van de luchtpijp kan leiden tot het onvermogen om het dier te ventileren in de hechtdraad. Dus, als u problemen luchtwegproblemen controleer de luchtpijp voor kleine gaatjes. Bevestigen de juiste plaatsing van de tube door directe visualisatie van de canule in de luchtpijp eerder blootgesteld boven de carina. Sluit de buis aan een ventilator. Wij raden een druk gecontroleerde ventilatie-techniek met behulp van een Servo 900 C van Siemens (DRE Veterinary, USA). Dieren zullen vervolgens worden geventileerd met behulp van piek inspiratoire druk van 10 mbar, de frequentie van 110 ademhalingen / min en een positief eind-expiratoire druk van 3-5 mbar met een FiO 2 = 0,4. Instellingen nodig zou kunnen hebben enkele aanpassingen die het makkelijkst kan worden bereikt door het controleren van de longen tijdens open thorax chirurgie. Zorg ervoor dat de longen niet zijn ingestort of overbelast. Ondanks het feit dat de Servo 900 C is gebouwd als ventilator voor de mens, het gebruik ervan in een druk gecontroleerde ventilator instelling werkt uitstekend voor de ventilatie van de muizen. Voer Blood gas analyse naar de normale gasuitwisseling (partiële druk van zuurstof, PaO 2 van 115 ± 15 mm Hg en de partiële druk van koolstofdioxide, Paco 2 van 38 ± 6 mmHg) te bevestigen na 4 tot 6 uur de tijd ventilatie met behulp van de i-STAT System (Abbott, USA). Monitor de hartfrequentie met een ECG (bijvoorbeeld Hewlett Packard, Böblingen, Duitsland). Zorg ervoor dat de hartfrequentie niet dalen tot onder 450. Als de muis ontwikkelt bradicardia controleert de temperatuur en de verdoving dosis / concentratie. Xylacin / Ketamin anesthesie leidt tot een hart hart van de 250 / min en wordt daarom niet aanbevolen. Breng een juiste vloeistof vervanging. Een infuus met fysiologisch zout 0,1 ml / uur via een arteriële of veneuze katheter moet voorafgaand aan het begin van ischemie worden uitgevoerd. Ook kan een zoutoplossing bolus van 500 ul worden gegeven ip voorafgaand aan de operatie. Thoractomy kan leiden tot een daling van de bloeddruk en kunnen extra zout boli vereisen. Na ischemie, kan een infusiesnelheid tot 1 ml / uur nodig zijn om een ​​gemiddelde arteriële bloeddruk boven 60 mmHg te houden en een voldoende reperfusie van cruciaal belang voor infarct kleuring met behulp van TTC te garanderen. Plaats een halsslagader (PE10, Tip OD (mm / "), Tapered> 0.024 mm/.011") voor continue registratie van de bloeddruk. De halsslagader wordt blootgesteld via stompe dissectie van de paratracheale spieren. Na verdere blootstelling en zorgvuldige vermijding van elk weefsel trauma (het bijzonder van de nervus vagus), wordt een katheter ingebracht in het vat met twee hechtingen en een kleine klem. Bevestig de arm om het lichaam voordat u begint met het ontleden van de slagader. Dit zal blootstellen een langer stuk van de slagader. Knoop aan het einde van het proximale deel van de halsslagader. Bevestig een grotere klem aan het einde van de hechting aanverkrijgen van spanning. Plaats een ander hechtdraad rond de slagader en ontleden de slagader van de zeer distale einde. Hier, een kleine klem. Gebruik micro-schaar om een ​​kleine diagonale opening in de slagader snijden. Houd de opening met een fijn pincet (Dumont, WPI) en vooraf de juiste maat katheter met je handen / tang. Maak een knoop met je tweede hechtdraad en zet de slagader. Draai de klem en vooraf de katheter verder. Bevestig de katheter met een aantal knopen en tape. 2. Techniek van een coronaire occlusie Ontleden van de huid en bloot de linker thorax muur met behulp van een stompe dissectie techniek. Snijd de spieren borstvin majors en minors aan de thorax wand bloot te leggen met een cauterisatie. Door aan de pectoralis major, de longen daalt, waardoor een pincet uit de elektrochirurgische unit kan worden gestoken, en, 1-3 mm boven de long, een horizontale lijn het oversteken van de scheurt moet worden gecoaguleerd. Door het gebruik van een afgestompte schaar, knip de thorax wand. Aangepast veiligheidsspelden, waar de vangst plaat is verwijderd en de stompe eind is gebogen, worden vervolgens gebruikt om de borstkas te openen. Ter vergemakkelijking van de definitieve plaatsing van de hechting, coaguleren en knip de thorax muur langs het membraan naar de linker zijde van de thorax. Expose het hart door het ontleden van het hartzakje. Om te voorkomen dat het middenrif bewegingen te verwijderen en snijd de diafragma zenuw. Gebruik een kleine natte katoenen stok met een tang en draai het hart naar de rechterkant. Identificeer de linker kransslagader (LCA) en zorg ervoor dat de longen niet te opgeblazen. Optimaliseren van de opening van de thorax om een ​​stevige bevestiging van het hart hebben bij het plaatsen van de hechting. Als de bloeddruk te laag is de identificatie zou worden gecompliceerd. Extra Boli van zout kunnen verbeteren identificatie van de LCA. De LCA is een helder rood schip het oversteken van de hart horizontaal (in tegenstelling tot de terugkerende aderen). Soms wordt de LCA gezien best zonder een microscoop. Gebruik niet te veel licht. Dit kan leiden tot reflecties maken van visualisatie onmogelijk te verbreken. Zodra de LCA is visueel geïdentificeerd, plaats een 8,0 nylon hechtdraad (Prolene, Ethicon, Notiefies, USA) rond de LCA. Voor de toepassing van intermitterende LCA occlusie, we goedkeuring gehecht aan een chronische model van cardiomyopathie 42 met behulp van een opknoping gewicht systeem. Rijg de hechting door middel van een klein stukje plastic buis (PE-10 buizen) met een stompe randen en bevestig twee kleine gewichten (1g, bijv. gebruik Eppendorf buizen gevuld met water) aan elk uiteinde. Met de gewichten vrij opknoping over een stang, moet de LCA onmiddellijk te worden afgesloten. Bovendien, als het gewicht is opgelucht, is LCA occlusie beëindigd in een keer. Succesvolle LCA occlusie moet worden bevestigd door een onmiddellijke kleurverandering van het schip van licht rood naar donker violet, verandering van kleur van het myocard door het vat (van helder rood tot wit) en de aanwezigheid van ST-verhogingen in het ECG. Tijdens reperfusie, de veranderingen van de kleur onmiddellijk verdwijnen. Houd het hart nat met een 37 ° C, zoutoplossing geweekt, stuk van hydrofiel katoen in heel (zie ook figuur 1). Kies je ischemie tijd volgens uw primaire belang. In feite, voor studies van cardioprotectieve effecten van IP, zou het ideaal zijn om een ​​ischemie tijd geassocieerd met een infarct in grootte van ongeveer 30 tot 40% van de AAR gebruiken. Zo zou het mogelijk zijn om veranderingen in beide richtingen, bijvoorbeeld kleinere maten met een hart-infarct IP of grotere infarct maten met een experimentele therapeutische of een specifieke gendeletie te tonen. Daarnaast, muizen met een grootte van het infarct van minder dan 50% meestal overleeft het experiment, terwijl infarct maten van 60 tot 80% zijn vaak niet overleefd en de dieren sterven voordat de reperfusie tijd is voltooid. Met behulp van ons model 10 minuten van myocardiale ischemie, gevolgd door 2 uur reperfusie resulteren in een infarct grootte van 3,5 ± 1,3% van de AAR. In tegenstelling, een ischemie tijd van 60 minuten resulteert in een gemiddelde grootte van het infarct van 42 ± 5,2% van de AAR (p <0,01) 39. Zo beschouwen we een 60 minuten van ischemie als ideaal om veranderingen in beide richtingen te bestuderen. Toch moet u mogelijk de ischemie tijd in te stellen in gen gerichte muizen met een verbreken fenotype. Kies het juiste moment reperfusie. Het reperfusie tijd is van cruciaal belang voor de TTC kleuring. De kleurloze verf wordt gereduceerd tot een baksteen-rood gekleurd precipitaat door dehydrogenases in aanwezigheid van de co-enzym NADH. Stervende cellen verliezen hun vermogen om NADH en daarom worden afgebakend als bleke gebieden binnen de rode gekleurde levensvatbaar myocard te behouden. Infarctgrootte afbakening van TTC vereist dat NADH is gewassen volledig uit de necrotische gebied. Echter, als reperfusie is niet lang genoeg is, kan infarctgrootte afbakening van TTC kleuren resulteren in een onderschatting van de werkelijke infarctgrootte 43. In onze handen, na een ischemie tijd van 60 min, de grootte van het infarct meting is gestegen van 11,5 ± 4,5% na 30 minuten tot 42,2 ± 5,1%na 120 minuten. Geen verdere toename van de grootte van het infarct kunnen worden gedetecteerd met langere reperfusie tijden (240 minuten) 39. Zo hebben we een 2 uur reperfusie periode, die lijkt ook redelijk in de context van cardiale enzymen determination.If je bedenkt ischemie conditionering raden, raden wij aan vier cycli van IP (5 min ischemie, 5 min reperfusie), gevolgd door een ischemie van 60 min en een reperfusie tijd van 2 uur. Onder deze omstandigheden was IP geassocieerd met een 3,2-voudige reductie van infarctgrootte van 42,2 ± 5,1% tot 13,3 ± 3,3% van de AAR 39. Echter, als gevolg van de opknoping gewicht systeem kan verschillende regimenten conditionering gemakkelijk worden toegepast. 3. Bepaling van de omgeving At Risk (AAR) en myocard infarct grootte Na inductie van een myocard infarct (met of zonder IP), is het gebied doorbloed door het LCA (gebied in gevaar, AAR) en de grootte van het infarct zelf zal worden bepaald met behulp van een kleuring techniek. Vervolgens zal infarct dan worden berekend als percentage van een myocardinfarct ten opzichte van de AAR. Om dit te doen, is een eerder beschreven dubbele kleuring techniek met blauwe en triphenyltetrazolium chloride Evan's (TTC) gebruikt 44. Bepaal de AAR door middel van retrograde injectie van 1% blauwe kleurstof Evan's in de aorta, terwijl de LCA is afgesloten. Als alternatief, als een carotis katheter op zijn plaats is, gebruik deze route voor Evans blauw injectie. Evans blauwe vlek zal alle myocardweefsel blauw, behalve de AAR. Het is van cruciaal belang voor deze stap om luchtbellen te voorkomen binnen de katheter, zoals ze zouden worden geïnjecteerd in de coronaire circulatie en het voorkomen van blauwe vlekken Evan's. Voorafgaand aan de Evans blauwe vlekken die u zou willen bloed voor cardiale enzymen metingen te verzamelen. Bovendien is het verwijderen van bloed door het injecteren van 5 ml van een zoutoplossing via een aorta-of carotis katheter aanbevolen. Accijnzen het hart en was in ijskoud 0,9% zoutoplossing Insluiten in 2% agarose. Gebruik geen heet agarose omdat dit succesvol zal verkleuring te voorkomen. Na 30 minuten bij +4 ° C (of 15 minuten -20 ° C), knip het hart in plakjes van 1 mm met behulp van een hart matrix of microtoom. Als u het hart in de vriezer te vermijden droge bevriezing die zal leiden tot niet-gekleurde harten. Incubeer de plakjes met 1% TTC bij 37 ° C gedurende 10 min met behulp van een 15 ml blauwe pet in een waterbad. Hierdoor kan de infarct gebied dat moet worden afgebakend als een wit gebied, terwijl levensvatbaar weefsel vlekken rood. Fixeer de gekleurde schijfjes met 10% fomaldehyde 's nachts. Door dit te doen, is het infarct gebied beter contrast verbeteren van de kwaliteit van de foto's. Bepaal het gebied in gevaar (AAR) en de grootte van het infarct via planimetrie het gebruik van de software NIH Image 1.0 45. Bereken het percentage van de infarct myocardium uit het gebied in gevaar. 4. Cardiac Enzyme meting Vanwege de beperkingen in verband met de TTC vlekken adviseren wij als extra uitlezing voor hartinfarct de ernst van de bepaling van cardiaal troponine I (cTnI) niveaus in het serum van muizen. Het bloed zal worden verkregen uit de poortader en serum cTnI niveaus worden dan bepaald met een kwantitatieve snelle cTnI assay (Life Diagnostics, Inc, West Chester, PA, USA). 5. Representatieve resultaten: Figuur 1. (A) Model van cardiale IP met behulp van een opknoping gewicht systeem van coronaire occlusie. Deze techniek vereist geen knoop voor coronaire occlusie. (B, C) chirurgische setup. (D) Afbeelding van een muizen-hart met de linker kransslagader (LCA, pijlen) na occlusie. Visuele identificatie van de LCA is noodzakelijk voor ligatie en ischemische preconditionering bij muizen. Een 8.0 nylon hechtdraad is geplaatst rond de LCA 1-2 mm onder de linker oorschelp. De hechting is voorzien van schroefdraad door een kleine plastic buis (*). Het einde van elke hechting is bevestigd aan een klein gewicht (1g) en de hechting wordt geplaatst over stangen aan beide zijden. (E) Bepaling van de AAR na LCA occlusie en retrograde injectie van blauwe kleurstof Evan's in de aorta. De AAR blijft onbesmet terwijl de rest van het myocard is blauw. Na incubatie van AAR weefsel met TTC, het infarct gebied bevlekt wit, terwijl levensvatbaar weefsel gekleurd rood.