Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi
Summary
Biofilm formato sulla superficie dei denti sono molto complesse ed esposte a continue sfide innata ed esogeni ambientali, che modulano la loro architettura, fisiologia e trascrittoma. Abbiamo sviluppato una serie di strumenti per esaminare la composizione, l'organizzazione strutturale e di espressione genica dei biofilm orali, che possono essere adattati ad altre aree di ricerca biofilm.
Abstract
Biofilm sono altamente dinamici, comunità organizzate e strutturate di cellule microbiche invischiato in una matrice extracellulare di densità variabile e composizione 1, 2. In generale, i biofilm si sviluppano da iniziale attaccamento microbica su una superficie seguita dalla formazione di ammassi di cellule (o microcolonie) e l'ulteriore sviluppo e la stabilizzazione del microcolonie, che si verificano in una complessa matrice extracellulare. La maggior parte dei esopolisaccaridi porto matrici biofilm (EPS), e biofilm dentali non fanno eccezione, in particolare quelli associati con la malattia di carie, che sono per lo più mediati da streptococchi mutans 3. L'EPS sono sintetizzati da microrganismi (S. mutans, un contributo fondamentale) per mezzo di enzimi extracellulari, come glucosyltransferases utilizzando saccarosio principalmente come substrato 3.
Studi di biofilm formato sulla superficie dei denti sono particolarmente impegnativo a causa della loro esposizione costante ai problemi ambientali associati alle complesse dieta-host-microbica interazioni che avvengono nella cavità orale. Una migliore comprensione dei cambiamenti dinamici della organizzazione strutturale e la composizione della matrice, della fisiologia e trascrittoma / proteoma profilo di biofilm-cellule in risposta a queste complesse interazioni avrebbe ulteriormente avanzare le conoscenze attuali di come biofilm orale modulare patogenicità. Pertanto, abbiamo sviluppato un strumento analitico-box per facilitare l'analisi biofilm a livello strutturale, biochimico e molecolare, combinando le tecniche comunemente disponibili e nuovi con misura software per l'analisi dei dati. Standard di analisi (test colorimetrici, RT-qPCR e microarray) e nuove tecniche di fluorescenza (per l'etichettatura simultanea di batteri e EPS) sono stati integrati con software specifico per l'analisi dei dati per affrontare la complessa natura della ricerca biofilm orali.
Il tool-box è composto da 4 fasi distinte ma interconnesse (Figura 1): 1) saggio biologico, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, e 4) Analisi dei dati. Abbiamo utilizzato il nostro modello in vitro di biofilm e alle specifiche condizioni sperimentali per dimostrare l'utilità e la flessibilità dello strumento-box. Il modello di biofilm è semplice, riproducibile e più replicati di un singolo esperimento può essere fatto contemporaneamente 4, 5. Inoltre, permette la valutazione temporale, l'inclusione di varie specie microbiche 5 e la valutazione degli effetti delle diverse condizioni sperimentali (trattamenti ad esempio 6; confronto di mutanti knockout vs ceppo parentale 5; carboidrati disponibilità 7). Qui, descriviamo due componenti specifiche del tool-box, tra cui (i) un nuovo software per microarray data mining / organizzazione (MDV) e l'analisi di imaging di fluorescenza (DUOSTAT), e (ii) in situ EPS di etichettatura. Forniamo anche un caso sperimentale che mostra come il tool-box può aiutare con l'analisi biofilm, i dati di organizzazione, integrazione e interpretazione.
Protocol
Discussion
In questa presentazione, abbiamo dimostrato due componenti critici del analitica Tool-Box (EPS / batteri imaging e microarray data mining / elaborazione), la versatilità e l'utilità dei vari metodi integrato nel sistema. Chiaramente, il tool-box facilitato l'analisi completa (comparativa) e simultanea dei diversi aspetti della biochimica biofilm, l'architettura e l'espressione genica in risposta alle diverse condizioni sperimentali utilizzando un modello in vitro. 7 Considerando i c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Gary Xie e Herbert Lee per lo sviluppo del MDV. Ringraziamo anche Drs. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-Gyu Jeon, Abranches Jacqueline, e la signora Stacy Gregoire per il loro contributo tecnico e scientifico per le componenti analitiche dello strumento-box. Questo studio è stato sostenuto in parte da USPHS ricerca concedere DE018023 dal National Institute of Dental Research e craniofacciale.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
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