وهو أداة تحليلية للعلبة التقييم الشامل الكيمياء الحيوية ، والهيكلية والأغشية الحيوية عن طريق الفم من Transcriptome بوساطة العقديات الطافرة
Summary
الأغشية الحيوية تشكلت على أسطح الأسنان معقدة للغاية وتتعرض للتحديات البيئية المستمرة الفطرية والخارجية ، والتي تعدل من الهندسة المعمارية ، والفيزيولوجيا وtranscriptome. قمنا بتطوير مجموعة أدوات لفحص تكوين وتنظيم هيكلية والتعبير الجيني من الأغشية الحيوية عن طريق الفم ، والتي يمكن تكييفها لمناطق أخرى من البحوث بيوفيلم.
Abstract
الأغشية الحيوية والديناميكية العالية ومجتمعات منظمة ومهيكلة من الخلايا الميكروبية المنغمسين في المصفوفة خارج الخلية من كثافة وتكوين متغير 1 ، 2. عموما ، تطوير الأغشية الحيوية الجرثومية الأولية من التعلق على سطح يليه تشكيل مجموعات خلايا (أو microcolonies) ومزيد من التنمية والاستقرار في microcolonies ، والتي تحدث في المصفوفة خارج الخلية المعقدة. غالبية exopolysaccharides بيوفيلم الميناء مصفوفات (EPS) ، والأغشية الحيوية الأسنان ليست استثناء ، خصوصا تلك المرتبطة بمرض تسوس ، والتي هي في الغالب التي توسطت العقديات الطافرة 3. وقد تم تجميع السهم من قبل الكائنات الحية الدقيقة (الطافرة S. ، مساهما رئيسيا) عن طريق الانزيمات خارج الخلية ، مثل السكروز glucosyltransferases به في المقام الأول باعتباره الركيزة 3.
دراسات الأغشية الحيوية تشكلت على أسطح الأسنان وتحديا من نوع خاص نظرا لتعرضهم المستمر لمواجهة التحديات البيئية المرتبطة بالنظام الغذائي التفاعلات المضيف الجرثومية المعقدة التي تحدث في تجويف الفم. وفهم أفضل للتغيرات دينامية التنظيم الهيكلي وتكوين مصفوفة ، والفيزيولوجيا وtranscriptome / ملف بروتيوم بيوفيلم من خلايا استجابة لهذه التفاعلات المعقدة المزيد من التقدم في المعرفة الحالية لكيفية الأغشية الحيوية عن طريق الفم تعدل المرضية. ولذلك ، قمنا بتطوير أداة تحليلية علبة لتسهيل التحليل بيوفيلم المستويات الهيكلية ، والكيمياء الحيوية والجزيئية من خلال الجمع بين التقنيات المتاحة عموما والرواية مع العرف صنع البرمجيات لتحليل البيانات. وتم دمج القياسية التحليلية (المقايسات اللونية ، RT qPCR وميكروأرس) وتقنيات مضان رواية (لوصفها في وقت واحد من البكتيريا وEPS) مع برامج معينة لتحليل البيانات للتعامل مع الطبيعة المعقدة للبحوث بيوفيلم عن طريق الفم.
وتتألف الأداة علبة من 4 خطوات متميزة ولكنها مترابطة (الشكل 1) : 1) اختبارات بيولوجية ، 2) إدخال البيانات الخام ، 3) معالجة البيانات ، و 4) تحليل البيانات. كنا في المختبر لدينا نموذج بيوفيلم والظروف التجريبية المحددة للتدليل على فائدة ومرونة من مربع الأدوات. ويمكن القيام بيوفيلم نموذج بسيط ، واستنساخه عدة نسخ متماثلة من تجربة واحدة في وقت واحد 4 ، 5. وعلاوة على ذلك ، فإنه يسمح تقييم الزمانية ، وإدراج مختلف أنواع الجراثيم (5) وتقييم الآثار المترتبة على ظروف تجريبية مختلفة (مثل العلاجات 6 ؛ مقارنة بالضربة القاضية مقابل المسوخ سلالة الأبوية 5 ؛ توافر الكربوهيدرات 7). هنا ، نحن تصف عنصرين محددة من مربع الأدوات ، بما في ذلك (ط) برامج جديدة لاستخراج البيانات ميكروأري / المنظمة (المالديف) ، وتحليل التصوير مضان (DUOSTAT) ، و (الثاني) في الموقع EPS وضع العلامات ونحن نقدم أيضا حالة تجريبية توضح كيفية الأداة علبة يمكن أن تساعد في تحليل الأغشية الحيوية ، وبيانات المنظمة ، والتكامل والتفسير.
Protocol
Discussion
في هذا العرض ، وأثبتنا عنصرين الحرجة للصندوق الأدوات التحليلية (EPS / البكتيريا ميكروأري التصوير واستخراج البيانات / التجهيز) ، وبراعة وفائدة مختلف المقايسات متكاملة في النظام. بوضوح ، وأداة مربع ، سهلت تحليل شامل (النسبية) في وقت واحد من جوانب مختلفة من الأغشية الحيوي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور غاري وشيه لي هربرت لتنمية المالديف. كما نشكر الدكاترة. سيموني دوارتي ، راميرو موراتا ، جون جاي كيو ، Abranches جاكلين ، والسيدة ستيسي غريغوار لمساهمتهم الفنية والعلمية لعناصر تحليلية من مربع الأدوات. وأيد هذه الدراسة في جزء من منحة بحثية USPHS DE018023 من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Leme, P. a. e. s., Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. u. r. y. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation–new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r., Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >., Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
