Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

1. Transfection של שורות תאים Transfection שיטה 1 (Lonza Nucleofection עבור מוגברת יעילות התא הראשוני transfection) תאים צריכים להיות מעבר האחרונות בצמיחה יומן שלב לפני transfection. שטפו תאים phophate שנאגרו מלוחים (PBS) ותאי הקציר ידי trypsinization. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1500 במשך 5 דקות. הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6 באר. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת. מקום 1.5 מ"ל של התקשורת בתרבות (במקרה זה מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)) לתוך כל טוב לאזן את התקשורת בחממה. קציר התאים על ידי trypsinization ו resuspend בהיקף מינימלי של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). ספירת התאים צנטריפוגות את הסכום הנכון של resuspension לספק ~ 5×10 5 תאים לדגימה. Resuspend התאים בקפידה 100 הטמפרטורה μL פתרון Nucleofector החדר המדגם. מערבבים 100 μL ההשעיה תא עם דנ"א 5 מיקרוגרם פלסמיד ולהעביר את המדגם כדי קובט Nucleofector נזהר שלא לכלול בועות אוויר. בחר את תוכנית Nucleofector המתאים (זה עשוי לדרוש בדיקה קודמת להקים transfection יעילות אופטימלית עם תמותה מינימלית). הכנס את קובט המכיל את ההשעיה תא / דנ"א לתוך המחזיק קובט Nucleofector ולהתחיל בתוכנית שנבחרה. בסיום, להסיר את קובט ולהוסיף ~ 500 μL של טרום equilibrated התקשורת בתרבות אליו (נלקח מתוך צלחת 6-היטב). מיד להעביר את הדגימה לתוך צלחת 6-היטב עם נפח סופי של 1.5 מ"ל לכל טוב. תאים צריכים להיות מצופה באחת אוכלוסיות מעורבות או בנפרד, עבור פקדי. Transfection שיטה 2 (Qiagen transfection Effectene עבור שורות תאים) הכן מתחמי transfection באמצעות מגיב Effectene Qiagen ידי הראשון מוסיף 0.8 מיקרוגרם של כל דגימה DNA פלסמיד למאגר 200 EC μL. הוסף 6.4 μL מגיב משפר מדגם זה, מערבבים בקצרה על ידי מצליף את הצינור, ואת דגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 20 מגיב Effectene μL לערבב כל המדגם, על ידי מצליף את הצינור, ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה זה, להכין את שתי שורות תאים של עניין transfection. שטפו תאים passaged לאחרונה (<80 מפגש%) פעם שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). הוסף גב 1.5 טרי מ"ל התחמם equilibrated צמיחה בינוני (במקרה זה שונה Dulbecco הנשר של המדיום (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)). לאחר מתחמי transfection יש מודגרות למשך 15 דקות, להעביר 1.2 מ"ל של התקשורת מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting, ומיד להעביר ~ 700 μL של קומפלקסים לכל אחד שתי בארות בצלחת 6-הבאר. הוסף dropwise, ומערבבים בעדינות ידי על ידי מתערבל את הצלחת. אפשר התאים transfect לפחות 3 שעות (עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא). הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6-באר חדשה. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת. אחרי התאים יש transfected, לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולאסוף את התאים על ידי trysinization מינימלי על ידי הוספת כ -100 פתרון טריפסין μL זה טוב, בקצרה להסעיר את הצלחת מעיל מלא כל טוב, ומיד aspirating את טריפסין. ברגע שהתאים נוקף, להוסיף 1.5 התקשורת טרי מ"ל. בשלב זה, התאים צריכים להיות מצופה באוכלוסיות או מעורבת או נפרדת (עבור פקדי) על גבי תלושי כיסוי סטרילי. אפשר לשחזר את התאים למשך 12 שעות. 2. תא Fusion הסר מדיה תרבות מן התאים ולשטוף פעמיים עם PBS. בשלב זה, מומלץ לטפל בתאים עם cycloheximide (100 מיקרוגרם / מ"ל) לעכב את סינתזת החלבון. אפשר התאים כדי לדגור על 2 שעות ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. נתיך תאים על ידי חשיפת אותם בתמיסה של 50% פוליאתילן גליקול 1000 (PEG 1000) בסרום ללא DMEM עבור 125 שניות בטמפרטורת החדר. שטפו תאים עם PBS להסיר את הפתרון 1000 PEG, ולהוסיף 2 מ"ל חימם טרי התקשורת equilibrated. אפשר תאים כדי לדגור במשך 18 – 24 שעות. Fluorescence מיקרוסקופית הסר את המדיה והתרבות, לשטוף את התאים פעמיים PBS. תקן תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) היטב כל אחד. להתסיס בעדינות במשך 15 דקות. לשטוף את התאים קבוע פעמיים PBS. הסר בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת, הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת הרכבה בינונית (90% גליצרול, 100mm טריס pH 7.5, DABCO 2% (1,4-diazabicoyclo אוקטן) DAPI המכיל (4 ',6-diamidino-2-phenylindole). הסר בינוני הרכבה עודף משקופיות, ואת החותם שיתוףver מחליק עם לק. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal או epifluorescence. 3. נציג תוצאות תרשים 2 מציג דוגמה heterokaryon הניסוי באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים סרטן ריאות מסוג תאים תאים. החלבון של עניין בניסוי הזה (אנמיה עוף Virus-VP3) מציג לוקליזציה cytoplasmic בעיקר סוגי תאים ראשוניים לוקליזציה גרעיני סוגי תאים טרנספורמציה כמו דמיינו ידי מיקרוסקופיה epifluorescence. החלבון מבוטא היתוך כדי או GFP (pEGFP-N1 וקטור, Clontech) ב fibroblasts העורלה הראשי (קרן היסוד) או dsRed (dsRed-N1 וקטור, Clontech) ב H1299 תאים. דגימות בקרת מעורבים עצמית fusions (שתי שורות למעלה) להציג תאים multinucleated ללא שינוי היציב דפוסי לוקליזציה. שינויים כאלה שעלולות להתרחש עקב רגישות לתנאי היתוך או היווצרות של syncitia. Fusions Heterokaryon (השורה התחתונה) להפגין כניסה הגרעיני של חלבון ה-GFP-התמזגו תאים שמקורם הראשוני colocalization עם חלבון dsRed-התמזגו בתגובה הקדמה של חומר תא שינה. הדוגמה המוצגת היא שילוב heterokaryon נדיר יחסית הנובעת רק שני תאים, אחד מכל סוג, כפי שמודגם על ידי נוכחות של שני אותות fluoroprotein. בנוסף לגילוי סוגים אלה של מעברים לוקליזציה, פעילות הלוך ושוב nucleocytoplasmic ניתן לאתר בקלות על ידי נוכחות של fluorophore יחיד גרעינים שניהם. זה סוג של נחישות ברורה כאשר בוחנים 01:01 fusions התא תלוי עיכוב של התרגום. באיור 1. תרשים זרימה של השיטה heterokaryon באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים קרצינומה של תאים סלולריים. הגן של עניין הוא משובטים כדי לייצר היתוך מסגרת אחת של שני גנים חלבון פלואורסצנטי. קווים סלולריים הם אז transfected transiently עם לבנות או ואיפשר להתאושש. היווצרות Heterokaryon הוא המושרה על ידי טיפול קצר עם פוליאתילן גליקול (PEG) ואחריו דגירה נוסף. לבסוף, לוקליזציה המשנה הסלולר של החלבון של עניין הוא ציין באמצעות צורות שונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 2. סחר Nucleocytoplasmic ו הלוך ושוב פעילות של חלבון אנמיה עוף וירוס VP3 דמיינו ידי היתוך heterokaryon. שורה עליונה: תמונות נציג עצמית התמזגו H1299 תאים להביע dsRed-VP3 שורה התיכון:.. תמונות epifluorescence נציג העיקרי תאים פיברובלסטים העורלה (קרן היסוד) להביע את ה-GFP-VP3 לאחר היתוך PEG שורה תחתונה: פיוז'ן Heterokaryon של קרן היסוד ו H1299 תאים. צהוב עולה colocalization-GFP אותות dsRed. תאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי AF6000E לייקה לייקה ותוכנות הדמיה.