Heterokaryon Technik zur Analyse von Zelltyp-spezifischen Localization

1. Transfektion von Zelllinien Transfektion Methode 1 (Lonza Nucleofection für erhöhte primäre Zelle Transfektionseffizienz) Die Zellen sind von den letzten Durchgang und in der log-Phase Wachstum vor der Transfektion werden. Wash-Zellen in phophate Kochsalzlösung (PBS) und Ernte-Zellen durch Trypsinierung. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 xg für 5 Minuten. Add sterilisiert Deckgläser mit einem 6-Well-Platte. Deckgläser kann für eine verbesserte Zelladhäsion beschichtet werden. Legen Sie 1,5 ml Kulturmedium (in diesem Fall Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS)) in jede Vertiefung und Gleichgewicht der Medien in den Inkubator. Ernte der Zellen durch Trypsinierung und resuspendieren in einem minimalen Volumen von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Zählen Sie die Zellen und Zentrifuge die richtige Menge der Resuspension auf ~ 5×10 5 Zellen pro Probe zu erhalten. Resuspendieren der Zellen vorsichtig in 100 ul Raumtemperatur Nucleofector Lösung pro Probe. Kombinieren Sie 100 ul Zellsuspension mit 5 ug Plasmid-DNA und übertragen Sie die Probe auf eine Nucleofector Cuvette man aufpassen, nicht, um Luftblasen enthalten. Wählen Sie das entsprechende Nucleofector Program (dies kann eine frühere Prüfung erforderlich, um eine optimale Transfektionseffizienz mit minimaler Mortalität zu etablieren). Legen Sie die Küvette mit der Zelle / DNA-Suspension in den Nucleofector Küvettenhalter und beginnen das ausgewählte Programm. Nach der Fertigstellung, entfernen Sie die Küvette und fügen ~ 500 ul der voräquilibriert Kulturmedien, um es (aus dem 6-Well-Platte). Unmittelbar Übertragung der Probe in die 6-well-Platte mit Endvolumen von 1,5 ml pro Vertiefung. Die Zellen sind entweder in gemischten Populationen oder separat beschichtet werden, für die Kontrollen. Transfektion Methode 2 (Qiagen Effectene Transfektion für die Zell-Linien) Bereiten Transfektionskomplexe mit dem Qiagen Effectene Reagenz, indem man zunächst 0,8 ug jedes Plasmid-DNA-Probe zu 200 ul EC-Puffer. Add 6,4 ul-Enhancer-Reagenz zu jeder Probe, kurz mischen Dazu den Schlauch, und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Add 20 uL Effectene Reagenz zu jeder Probe, mischen durch flicking das Rohr, und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Während dieser Inkubation, bereiten sich die beiden Zelllinien von Interesse für die Transfektion. Wash kürzlich passagiert Zellen (<80% Konfluenz) einmal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie wieder 1,5 ml frisch aufgewärmt und äquilibriert Wachstumsmedium (in diesem Fall Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS)). Nach der Transfektion Komplexe für 15 Minuten inkubiert, Übertragung 1,2 ml Medium zu jeder Probe. Mix durch Pipettieren und sofort in die ~ 700 ul der Komplexe zu jedem der beiden Brunnen in der 6-Well-Platte. Fügen Sie tropfenweise zugeben und durch sanft durch Schwenken der Platte. Lassen Zellen für mindestens 3 Stunden transfizieren (kann mit Zelltyp variieren). Add sterilisiert Deckgläser, um eine neue 6-well-Platte. Deckgläser kann für eine verbesserte Zelladhäsion beschichtet werden. Nachdem die Zellen transfiziert wurden, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Ernte der Zellen durch minimale trysinization durch Zugabe von ca. 100 ul Trypsin-Lösung in jede Vertiefung, kurz Schütteln der Platte voll Fell jede Vertiefung, und sofort Absaugen der Trypsin. Sobald die Zellen angehoben haben, fügen Sie 1,5 ml frisches Medium. An diesem Punkt sollten die Zellen entweder in gemischten oder getrennten Populationen (für Kontrollen) auf die sterile Deckgläser plattiert werden. Lassen Zellen für 12 Stunden zu erholen. 2. Zellverschmelzung Entfernen Kulturmedien aus den Zellen und waschen zweimal mit PBS. An dieser Stelle empfiehlt es sich, die Zellen mit Cycloheximid (100 ug / mL) zu behandeln, um die Proteinsynthese zu hemmen. Lassen Sie die Zellen für 2 Stunden inkubiert und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fuse-Zellen indem sie zu einer Lösung von 50% Polyethylenglykol 1000 (PEG 1000) in serumfreiem DMEM für 125 Sekunden bei Raumtemperatur. Wash-Zellen mit PBS, die PEG 1000-Lösung zu entfernen, und fügen Sie 2 mL frisch aufgewärmt und äquilibriert Medien. Lassen Zellen für 18 inkubieren – 24 Stunden. Fluoreszenz-Mikroskopie Entfernen Sie den Kulturmedien, und waschen Sie die Zellen zweimal in PBS. Fix-Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Vorsichtig für 15 Minuten rühren. Waschen Sie die fixierten Zellen zweimal in PBS. Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser von der Platte, überschüssiges PBS Docht. Invert auf Objektträger geladen mit einem Tropfen Eindeckmedium (90% Glycerin, 100 mM Tris pH 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-Oktan) mit DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindole). Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium vom Rutschen und Dichtung cover rutscht mit Nagellack. Visualisieren Sie die Zellen über konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie. 3. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt ein Beispiel heterokaryon Experiment mit primären Fibroblasten und H1299 nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom-Zellen. Das Protein von Interesse in diesem Experiment (Chicken Anämie Virus-VP3) zeigt in erster Linie zytoplasmatische Lokalisation im primären Zelltypen und nukleare Lokalisation in transformierten Zelltypen wie visualisiert Epifluoreszenzmikroskopie. Das Protein wird als Fusionsprotein entweder GFP (pEGFP-N1-Vektor, Clontech) in primären Vorhaut-Fibroblasten (PFF) oder dsRed (dsRed-N1-Vektor, Clontech) in H1299-Zellen exprimiert. Kontrollproben mit Selbst-Fusionen (obere zwei Zeilen) angezeigt mehrkernige Zellen ohne Veränderung der Steady-State-Lokalisierungs-Muster. Solche Veränderungen könnten sonst entstehen durch Sensibilität für Fusion Bedingungen oder die Bildung von Syncytien. Heterokaryon Fusionen (untere Reihe) zeigen nuklearen Eingabe der GFP-fusionierten primäre cell-derived Protein und Kolokalisation mit dem dsRed-Fusionsprotein in Reaktion auf die Einführung von transformierten Zellmaterial. Das gezeigte Beispiel ist eine relativ seltene heterokaryon Fusion aus nur zwei Zellen, eine von jeder Art, wie durch die Anwesenheit der beiden Fluorprotein Signale gezeigt. Neben der Erkennung dieser Art von Lokalisierungs-Übergänge, kann nukleozytoplasmatischen pendelt Aktivität leicht durch die Anwesenheit eines einzigen Fluorophor in beide Kerne erkannt werden. Dieser Typ der Bestimmung ist klar, bei der Prüfung 01.01 Zelle Fusionen und würde auf der Hemmung der Translation abhängig. Abbildung 1. Ablaufschema der heterokaryon Methode unter Verwendung von primären Fibroblasten und H1299 non-small cell carcinoma-Zellen. Das Gen von Interesse ist geklont, um eine in-frame Fusion zu einem von zwei fluoreszierende Protein-Gene zu erzeugen. Zelllinien werden dann vorübergehend mit entweder Konstrukt transfiziert und erlaubte sich zu erholen. Heterokaryon Bildung wird durch eine kurze Behandlung mit Polyethylenglykol (PEG) durch weitere Inkubation induziert. Schließlich ist die sub-zelluläre Lokalisation des Proteins von Interesse beobachtet mit verschiedenen Formen der Fluoreszenz-Mikroskopie. Abbildung 2. Nukleozytoplasmatischen Menschenhandel und pendelt Aktivität der Hühner Anämie Virus VP3 Protein visualisiert heterokaryon Fusion. Obere Reihe: Repräsentative Bilder selbst verschmolzen H1299 Zellen, dsRed-VP3 Mittlere Reihe:.. Vertreter Epifluoreszenz Bilder von primären Vorhaut-Fibroblasten-Zellen (PFF), die GFP-VP3 nach PEG Fusion Untere Reihe: Heterokaryon Fusion von PFF und H1299 Zellen. Gelb bedeutet Kolokalisation von GFP und DsRed-Signale. Die Zellen wurden aufgenommen mit einem Leica AF6000E Fluoreszenzmikroskop Leica und Imaging-Software.