متغايرة النوى وتقنيات لتحليل نوع من الترجمة الخاصة الخليوي
Summary
يوصف أسلوب مرن وفعال للتوصيف توطين الخلية البروتين من نوع معين والنواة للهيولى مكوكية. هذا النهج يستخدم متغايرة النوى البروتينات الانصهار fluorescently المسمى لتعريب صورة بعد انصهار بروتين الخلية. بروتوكول غير قابلة للتعريب والمطرد للدولة أو تحديدات أكثر ديناميكية تقوم على تصوير الخلايا الحية.
Abstract
ويتم تنظيم عدد كبير من البروتينات عن طريق الاتجار أو التحت خلوية nucleocytolasmic مكوكية. هذه البروتينات عرض مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية النووية بما في ذلك استيراد / تصدير RNA والبروتين ، وتنظيم النسخي ، وموت الخلايا المبرمج. ومن المثير للاهتمام ، بما في ذلك إعادة تنظيم الخلوية الرئيسية انقسام الخلايا ، والتمايز والتحول ، وغالبا ما تنطوي على مثل هذه الأنشطة 3،4،8،10. يمكن للدراسة مفصلة لهذه البروتينات وآلياتها التنظيمية ذات الصلة كما يمكن أن يكون تحديا لتحفيز هذه التغييرات يمكن توطين بعيد المنال ، والحركات نفسها أن تكون دينامية للغاية ويصعب تتبع. الدراسات التي تنطوي على oncogenesis الخلوية ، على سبيل المثال ، الاستمرار في الاستفادة من مسارات التفاهم والأنشطة التي تختلف البروتين بين الخلايا الطبيعية والخلايا الأولية تحولت 6،7،11،12. كما تظهر العديد من البروتينات التعريب غيرت خلال التحول أو نتيجة للتحول ، وأساليب تتسم بكفاءة هذه البروتينات ، والمسارات التي تشارك فيها موقف لتحسين فهم oncogenesis ومجالات جديدة تفتح لمكافحة المخدرات والاستهداف.
هنا نقدم طريقة لتحليل البروتينات والاتجار في رحلات مكوكية بين نشاط خلايا الثدييات الأولية وتحويلها. هذا الأسلوب يجمع بين جيل من اندماج متغايرة النوى مع مضان المجهري لتوفير بروتوكول مرنة يمكن استخدامها للكشف عن البروتين تعريب وثابتة للدولة أو حيوية. كما هو مبين في الشكل 1 ، transfected عابر نوعين خلية منفصلة مع ثوابت بلازميد يحمل جينات fluoroprotein تعلق على الجينات في المصالح. بعد التعبير ، وتنصهر في الخلايا باستخدام مادة البولي ايثيلين جلايكول ، ويجوز عندئذ تعريب البروتين يمكن تصوير باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. بروتوكول المقدمة هنا هو النهج الأساسي الذي يمكن أن تضاف التقنيات المتخصصة.
Protocol
Discussion
قدمت بروتوكول متغايرة النوى هنا يوفر طريقة فعالة وسهلة التأويل للتوصيف السلوك الخلية توطين نوع معين ، وكذلك النواة للنشاط مكوكية. هذا الأسلوب يستفيد من حساسية التحليل مضان فضلا عن القدرة على الخلايا الحية والصور إجراء دراسات لديناميات البروتين. ويتم تكييف هذه التقنية بسهولة لكثير من أنواع مختلفة من الخلايا ، وهي قابلة لكلا التصوير الخلية الحية والثابتة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام المجهر مضان مقلوب لتصوير والتقاط يعيش الفيديو في الوقت الفاصل. على النقيض من ذلك ، يمكن استخدام الخلايا التي تقام في epifluorescence إما المجهري لتحديد حالة استقرار تعريب أو التصوير مبائر أكثر تفصيلا للتعريب ومنفصلة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching (FRAP) ، أو خسارة في مضان photobleaching (FLIP) في تحديد حركية التعريب 1. فإن إدماج fluorophores بديل في البروتوكول يسمح للتجارب التفاعل البروتين مثل مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) التي ستجرى في الحفلة 2. ران مثبطات مختلفة من الاتجار الخلوية مثل B أو الغالبة leptomycin السلبية يمكن استخدامها لإقامة بنيات GTPase الاعتماد على استيراد معين أو مسارات تصدير 5،6،9.
- في التجارب التي تنطوي على بعض النشاط في رحلات مكوكية ، لا بد من توخي الحذر لتجنب آثار التعريب بسبب توليف البروتين الجديد. في هذه الحالات ، يجب استخدام مثبطات الترجمة أو نقطة زمنية محدودة. ومع ذلك ، نظرا لتثبيط التحف متعدية يبقى الاحتمال. ومعظم المطلوب اندماج الخلية التي تحتوي على واحدة من كل نوع من الخلايا لتفسير واضح للتوطين مكوكية والسلوك. قد الأمثل لعدد الخلايا وشروط الاندماج (توقيت وتركيز) قد يكون ضروريا لتعزيز هذا الانصهار 01:01 مواتية الأحداث.
- ومن المهم أن نلاحظ أن الاستفادة المثلى من خطوات معينة في البروتوكول سوف يكون من الضروري تبعا لأنواع معينة تستخدم الخلية. قد الجوانب في الإجراء التجريبي مثل كفاءة الانصهار ، ترنسفكأيشن الكفاءة ، وقدرتها على البقاء بعد انصهار تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الخلايا. على وجه الخصوص ، يمكن أن أنواع الخلايا الأولية أن يكون تحديا لإدارة بسبب الظروف المعقدة والثقافة ترنسفكأيشن الكفاءة المنخفضة. ويمكن استخدام تقنيات مثل الجهاز Nucleofector Lonza سماح للتجهيز السريع للخلايا ، وكذلك الكفاءات ترنسفكأيشن زيادة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، وأساليب electroporation تسمح لسهولة نقل الخلايا في التعليق على الخطوات التي تتبع الانصهار.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر معهد البوليتكنيك ورسستر قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية للحصول على التمويل.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | ||
| Trypsin | Fisher | SH3023602 | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher | SH30243FS | High glucose | |
| paraformaldehyde | FisherChemical | O4042-500 | ||
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | ||
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Scientific | SH3008803HI | ||
| Falcon 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | ||
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher | 528875-25GM | ||
| Cover slips | Fisher | 12-545-85 | ||
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | ||
| Nucleofector HDF kit | Lonza | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -. F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
