Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

1. Preparação solução Meio de cultura com ar-buffering capacidade Encher uma garrafa de 1 litro com cerca de 800 mL estéreis H 2 O (MilliQ autoclavada H 2 O). Agitando, adicione e misture as seguintes substâncias: 1 recipiente de glicose baixa, sem soro DMEM 2902 pó sem bicarbonato de sódio e fenol vermelho (vermelho de fenol interfere com o sinal de bioluminescência), 20 mL B27 suplemento 50x, 4,7 mL de uma NaHCO 3 7,5% solução (ou 0,35 g NaHCO 3), 10 mL HEPES 1M, 2,5 mL PenStrep 10.000 U / mL e 3,5 g de D-glucose. Deixe o médio mexa até que os ingredientes são completamente dissolvido. O meio de final (1 litro) conterá: 1x DMEM, 1x B27 suplemento, 4,2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / mL de penicilina, 25 U / mL de estreptomicina e 19 mM D-glicose. Ajustar o pH para 7,2, utilizando NaOH para diminuir ou HCl para aumentar o pH, e trazer o volume até 1 litro com estéril H 2 O. Ajuste osmolalidade com H 2 O (osmolalidade diminuição) ou glicose D-(osmolalidade aumento). A osmolalidade deve estar entre 285-315 mOsm / Kg, mas o intervalo ideal é 300-310 mOsm / Kg. Não diluir o meio mais de 5%. Filtro de meio de cultura usando conjuntos de vácuo Corning filtração estéril (por exemplo, 2 x 500 mL com dimensão de poro 0,22 mm) em um capuz estéril. Manter o meio em 4 ° C e proteger da luz usando uma folha de alumínio. Recomendamos que o meio é usado dentro de 3 meses. Balanceada de Hank sal solução tampão (HBSS) com suplementos (por fatias de corte) Encha uma garrafa de vidro 1 litro com ~ 600 mL estéril (autoclavada MilliQ) H 2 O e adicione as seguintes substâncias: 100 ml de caldo de HBSS 10x, 10 mL penicilina estreptomicina-10000 U / mL, 5 mL de um 7,5% NaHCO 3 e solução 10 mL HEPES 1M. A solução de corte final conterá: 1x HBSS, 10 mM HEPES, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / mL de penicilina e estreptomicina 100 U / mL. Verificar o pH e, se necessário, ajustar o pH para 7,2 e trazer o volume até 1 litro com estéril H 2 O. Verificação da pressão osmótica, que deve estar entre 285-315 mOsm / Kg. Resfriar o HBSS a 4 ° C. O buffer de HBSS precisa ser muito fria (4 ° C) durante o corte / corte procedimento, a fim de derrubar o metabolismo e preservar a viabilidade do tecido. 2. Antes de preparações Fatias de corte e Cultivo Os tecidos são cultivadas em uma câmara quente e seco, sem CO 2. Para evitar ressecamento as culturas precisam ser seladas com óculos tampa instalada para os pratos de massa. Para este fim, preencher 5 mL seringas com base de silicone graxa de vácuo. Cobrir as pontas de seringa com pequenos pedaços de papel alumínio e autoclave-los. Além disso, autoclave filtro de papel (usado durante a corte procedimento). Direito antes de cortar procedimento, aplique graxa de vácuo autoclavado na superfície do anel superior de 35 milímetros pratos petri. Prepare uma placa de Petri separadas para cada cultura fatia. Antes de iniciar o corte procedimento de todos os instrumentos não estéreis, lâminas de barbear, lâminas vibratome, óculos de tampa e outro material usado para o procedimento de corte e cultura devem ser esterilizados. Spray de todos os equipamentos não esterilizados com álcool 70%. Expor os instrumentos e as placas de Petri untada com UV em uma capa estéril para pelo menos 30 minutos de exposição UV antes cultivo. Ao mesmo tempo, encher um tubo de Falcon com ar-buffering meio de cultura (contagem de 1,2 mL para cada cultura, para preparar 8 culturas, por exemplo, média de 10 mL) e adicione luciferina recém-descongelado (0,1 M solução estoque; Promega, Madison, WI) (10 luciferina mL a 10 mL médio; concentração final 0,1 mM). A luciferina é sensível à luz e soluções tanto de ações e do meio-luciferina contendo precisam ser protegidos da luz. Coloque o tubo de Falcon com luciferina médio em uma câmara de aquecimento escuro 36-37 ° C. Se necessário, a luciferina também pode ser adicionado diretamente na placas de cultura no momento da corte. Se luciferina não é adicionado, não haverá reação luz entre luciferase e luciferina e, portanto, nenhum sinal do tecido. Após a exposição UV, anexar uma lâmina estéril para o vibratome. 3. SCN Slicing Procedimento O procedimento a seguir descreve corte de adultos, geralmente 2-4 meses de idade, C57/BL6 camundongos. Atenção: o procedimento de corte, bem como a exposição à luz do animal durante a noite, pode diferencialmente redefinir a fase do SCN. Para evitar isso, o corte eo cultivo deve ser realizado durante as horas de luz, de preferência entre ZT 12/06, quando não há mudanças substanciais fase devido ao procedimento ocorrer 12. Se SCN tem que ser amostrados em trevas, 3.1 e 3.2 devem ser realizados no sinal vermelho ou com óculos de noite para evitar mudanças de luz induzida por fase. Anestesiar o mouse de preferência por isofluorano (Baxter) em um glass câmara. Quando o animal perdeu sua dor reflexos (verifique apertando com as unhas nas patas), mas ainda não parou de respirar (para manter o suprimento de oxigênio máximo de tempo possível), rapidamente decapitar a cabeça com um par de tesouras ou similares. Por favor note: em alguns países CO 2 exposição (hipercapnia) ainda é permitido como método anestésico, embora tenha sido relatado para promover a ansiedade animal. Além disso, o deslocamento cervical pode ser necessária antes de decapitação. Por favor, siga as legislações locais, quando a eutanásia de animais. Remove os olhos da cabeça com uma tesoura, a fim de evitar o cansaço e excitação adicional do nervo óptico, que pode danificar o SCN. Se ainda ligado, retire a vertebrados última cervical com uma tesoura, retire a pele (Fig. 1a) e fazer dois cortes com um belo par de tesouras (por exemplo, uma tesoura de íris), um corte em cada lado do crânio ao longo dos lados, tornando assim uma "tampa" removível. Abrir o crânio com uma ferramenta de micro rongeur (multa tesouras de dissecação também pode ser usado em um mouse) e remover todos os ossos até o bulbo olfatório pode ser visto. Trabalho nunca para cima, pressionando o cérebro com a ferramenta, a fim de evitar danos do SCN ventral (Fig 1b). Corte cuidadosamente o nervo óptico entre os bulbos olfativos e os hemisférios usando micro fina dissecação tesoura primavera. Certifique-se que o nervo é completamente cortada desde alongamento do nervo óptico pode levar a danos no SCN e fatias de ruptura. Gire a cabeça para baixo e deixe que o cérebro intacto cair (se ainda ligado ao cérebro, outros nervos cranianos pode precisar de ser cortado caudal ao nervo óptico) em um recipiente (por exemplo, uma placa de Petri de vidro ≈ 10 cm) preenchido com 50-100 mL HBSS frio permitindo um rápido resfriamento do cérebro. Idealmente, os dois nervos ópticos devem permanecer intacta (Fig 1c). Manter o cérebro em HBSS 30-60 segundos para se certificar de que o cérebro é resfriado. Use uma colher ou similar e colocar o cérebro refrigerados, superfície dorsal para cima, sobre uma superfície de corte estéril (por exemplo, um vidro de tampa placa de Petri de cabeça para baixo). A fim de preparar um corte coronal, faça um corte perpendicular com lâminas de barbear ou bisturis esterilizados entre os hemisférios cerebrais eo cerebelo, removendo assim o cerebelo. Aplicar supercola na plataforma seca pertencente ao vibroslicer / vibratome. Pegue o cérebro (hemisférios cerebrais, sem cerebelo e sem bulbos olfativos), inserindo um acentuado, fórceps curvos na parte rostral e cuidadosamente secar o HBSS em um papel filtro estéril, ainda segurando o cérebro com a pinça. (Ao invés de inserir uma pinça, um pequeno pedaço de papel de filtro estéril pode ser usado para prender e transferir o cérebro). Corrigir os hemisférios para a plataforma colado com a ponta para cima rostral e superfície ventral mais próximo à lâmina de corte. Anexar a plataforma no suporte pertencentes à vibratome (por exemplo, de Campden Instruments, UK) e imediatamente preenchê-lo com HBSS frio. Se o corte perpendicular é feita corretamente, os hemisférios devem estar em linha reta até proporcionando assim um bom ângulo necessário para fazer um corte coronal contendo o SCN bilateral. A fim de alcançar a área SCN-alvo, começar a cortar seções mais espessas (500-800 mm) dos hemisférios em alta velocidade ou máximo do vibratome. Movendo a lâmina pode ser bastante rápido no início antes de atingir o hipotálamo, mas deve ser mais lento quando o quiasma óptico torna-se visível (alta freqüência da lâmina de vibração e movimento lento na horizontal diminui o dano celular durante o corte, aumentando assim a viabilidade fatia). Reduzir as seções de 100 mm, quando o quiasma óptico torna-se maior (mais largo) e comissura anterior torna-se menor. A fim de adquirir uma seção mid-SCN, trabalho sozinho "down" (sentido caudal) até os núcleos SCN dois começam a aparecer. A lupa pode ser necessário para a visualização dos núcleos. Atenção: o SCN no cérebro do rato fica mais caudal do quiasma óptico em comparação com o cérebro do rato. Quando o nível desejado de SCN foi alcançado (o SCN vai neste momento aparecem como mais definida, redonda ou estruturas em forma de amêndoa; 1d Fig; aproximadamente bregma-0.46–0,70 mm para a região centro do SCN em camundongos 13, bregma – 0,92 mm para -1,40-rat 14), cortar a seção SCN (Fig. 1e). Espessura adequada da fatia é para o mouse 250 ± 50 mm; para rato 350 ± 50 mm. Usando uma escova macia, levante e transferência da fatia SCN para uma tampa de uma placa de petri de tamanho médio, cheios de HBSS frio, colocado sob um microscópio de dissecação ou estereoscópio. Verifique se sob a ampliação do SCN bilateral é claramente visível. Se o meio-região do SCN será escolhido (que pode não ser necessariamente o único nível fatia "ideal", mas que nós consideramos é a maneira mais fácil de padronizar o procedimento de corte e reduzir a variação), ele deve ser visto claramente pelo menos em um lado doseção fatia. Se o corte era muito rostral, fazer uma outra seção e verifique se o SCN sob a ampliação. 4. Cultura SCN organotípicas Na tampa placa de petri preenchida com HBSS, dissecar o SCN bilateral como um tecido quadrado (~ 1,5 milímetros de cada lado) com um par de bisturis esterilizados sob um microscópio de dissecação. Um pequeno pedaço do quiasma permanecerá ligado ao explante, mas não há outros núcleos deverão ser incluídos. Corte o mais próximo possível, sem remoção de tecido SCN. Se apropriado para o experimento planejado, o SCN bilateral pode então ser cortada ao meio para obter duas SCN unilateral. Um SCN unilateral pode então ser usado como controle (Fig 2a). Preencha 1200 mL da luciferina médio em uma placa de Petri ≈ 35 mm e coloque uma membrana cultura (Milli-CM 0,4 mM, Millipore, Bedford, MA) no topo da superfície do líquido (2b). O volume de meio de cultura é fundamental, pois a membrana cultura deve sentar-se firmemente na base da placa de cultura, e não flutuar ou rocha no meio de 11. Certifique-se que não há bolhas de ar sob a membrana. Evitar a exposição desnecessária de luz quando se trabalha com luciferina. Os explantes são pequenas e difíceis de pegar. Portanto, use uma pipeta 1000 mL + ponta para sugar o explante SCN na ponta e pressione-o para fora da membrana. No caso de o explante é demasiado grande para caber facilmente em uma ponta da pipeta 1000 mL (por exemplo, SCN rato, e rato SCN bilateral) a ponta pode ser cortado com uma ferramenta estéril para criar uma maior abertura. Descartar HBSS excessiva sobre a membrana com a pipeta. Para a gravação de luciferase, coloque apenas um SCN / prato (Fig. 2b), como os tubos de gravação detectar todos os fótons emitidos a partir do prato e não distinguir entre sinais de diferentes tecidos. Selar o prato com uma tampa de vidro (≈ 40 mm, Menzel-Glaser, Alemanha) e graxa de vácuo (Dow Corning Corp, EUA) 11. Verifique se a vedação é apertado (Fig 2c). Se não, o selo com mais gordura. Transferir as placas para uma câmara de 36-37 ° C à prova de luz e começar a PMT-gravações imediatamente. 5. Medição da atividade de luciferase pela bioluminescência de gravação Sinais luciferase induzida bioluminescência do tecido SCN pequenos são detectados e amplificados com photonmultiplier tubo de assembléias (PMT) detector montado dentro de uma câmara de luz apertado. Os PMTs são normalmente posicionados ~ 1-2 cm acima da placas de cultura 8. PMT configurações de gravação podem ser feitos ou estão disponíveis comercialmente 11. Coloque o prato em um PMT (o calor produzido a partir da PMT irá remover a condensação no vidro da tampa) e feche a câmara. Certifique-se que a câmara é de 100% à prova de luz como a contagem de PMTs escuro usado para tecidos SCN é muito baixo (menos de 20 fótons / min). Os PMTs detectar até mesmo a fuga mais fraca luz. Iniciar a aquisição de dados, que é realizado com o software (por exemplo LumiCycle; Actimetrics Inc., Wilmette, IL, EUA). Contagens de fótons são integrados em intervalos de 10-10 min para chegar em alta resolução da expressão de genes / proteínas. Depois de terminada a gravação, a expressão obtidos circadiano do gene / proteína pode ser analisada com o software adequado (Origin, OriginLab, Northampton, MA, EUA; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, Till Roenneberg, da Universidade de Munique, Munique, Alemanha) para determinar fase, período (tempo para um ciclo) e da amplitude do ritmo. A expressão máxima do gene ou proteína é principalmente usado como ponto de referência e é definido como a maior quantidade de fótons durante um ciclo. Os dados podem ser suavizados, antes do período de análise de fase e amplitude, especialmente se a relação sinal / ruído é baixa. A linha de base às vezes muda e precisa ser subtraído antes as análises são realizadas. 6. Resultados representativos: Nós aqui apresentar o PER2 oscilatório:: LUC expressão como ler para a viabilidade ea condição do tecido cultivado. Em condições óptimas, e se o tecido está vivo, o PER2:: Expressão LUC oscila com um ritmo circadiano, como mostrado na figura 3. PER2 no SCN é maximamente expressa normalmente em torno de Zeitgeber Tempo 12-13 (ZT onde 12 representa luzes apagadas em um 12:12 hr luz: ciclo escuro). A maior em tamanho do tecido vivo é, quanto maior a contagem de fótons se torna. No entanto, o tamanho ea espessura do tecido organotypically cultura deve ser mantido pequeno, a fim de manter o tecido viável, preferivelmente não maior que 15 mm 2 11 e não mais grosso do que 500 mm 7. O SCN, se dissecados como descrito aqui, tipicamente mostra contagens de fótons entre 10.000-40.000/min se o tecido é amostrado a partir de um PER2 homozigótica:: animal LUC. A amplitude da oscilação nas culturas SCN organotípicas é normalmente muito alta durante o primeiro ciclo, em comparação com os ciclos seguintes. Não está inteiramente claro por que o primeiro ciclo tem amplit muito altaude. Uma possível explicação é que uma parcela substancial de células no tecido podem morrer logo após o corte inicial e cultura, portanto, não utilizando luciferina após o primeiro ciclo. O procedimento de corte também pode causar excitação excessiva, o que poderia amplificar o sinal luciferase durante o primeiro ciclo. A Figura 3 mostra os traços de luminescência de fatias SCN e contém um trace (vermelho) obtido a partir de uma fatia que não foi inicialmente saudáveis. Tecidos mortos ou insalubre têm baixa baselines contagem de fótons. (Além disso, tecidos mortos frequentemente dissociar no prato e não pode ser removido da membrana em uma peça.) A técnica descrita neste relatório pode ser usado beneficamente em experimentos farmacológicos. A Figura 4 mostra um traço de uma cultura que nós tratamos entre os dias 1 e 2 com um bloqueador dos canais de HCN (ZD7288, 10 mM). Como pode ser visto na figura e, como publicado anteriormente 15, o bloqueador reduziu significativamente a amplitude da oscilação circadiana dos PER2, no entanto, após a lavagem com meio de cultura normal, a oscilação voltou, mostrando que o bloqueador de afetou o relógio molecular, mas a tecido era viável e saudável. Figura 1. Corte procedimento A) A cabeça de um rato sacrificados decapitado com os olhos ea pele removida. B) O crânio é removida com uma ferramenta rongeur micro. Ao usar a ferramenta, é preciso trabalhar para cima e nunca pressione o cérebro com a ferramenta. C) O cérebro mostrado de cabeça para baixo (até face ventral), sem bulbos olfatórios. O quiasma óptico branca com as duas intactas nervos ópticos pode ser visto. O núcleo supraquiasmático (SCN, as fronteiras marcadas com cor vermelha) está localizado próximo ao quiasma óptico. D) E Um cérebro coronalmente corte ligado à plataforma no vibroslicer, ao nível do SCN.) Seção cérebro Coronal (250 mm de espessura) contendo o quiasma óptico (OC), terceiro ventrículo (3V) e os núcleos bilateral supraquiasmático (SCN). Figura 2. Cultura de tecidos organotípicas. A) Os dois núcleos SCN unilateral (inserir) dissecada da fatia mostrado. B) prato Cultura (35 mm placa de Petri), com membrana de cultura, médio e explante, mas sem graxa de vácuo e tampa de vidro. O meio (1,2 mL) pode ser visto como líquido entre o prato ea membrana. Um núcleo SCN unilateral é colocado na membrana cultura. O branco parte do tecido de pequeno porte é um pedaço do quiasma óptico (inserir). C) A placa de cultura com sua membrana e seu tecido SCN, vedados com graxa de vácuo e uma tampa de vidro redondo. Figura 3. Gravações de bioluminescência de culturas de tecidos saudáveis ​​e não-saudáveis ​​SCN. Exemplos de gravações bioluminescência de período2:: expressão no núcleo supraquiasmático (SCN) fatias obtidas de camundongos mantidos em uma 12h: (LUC PER2:): luciferase ciclo escuro: a luz 12h. O PER2:: proteína LUC oscila com uma variação (~ 24 h) circadiano em que a expressão máxima da proteína ocorre em Zeitgeber tempo 12-13. Assim, a fase do ritmo gene depende do cronograma luz negra em que o animal foi mantido antes sacrificado. Tipicamente, a bioluminescência dos tecidos dissecados SCN unilateral, como descrito no protocolo mostra contagens de fótons entre ~ 10.000-40.000/minute. A figura mostra os traços de uma cultura saudável SCN (preto), uma cultura SCN não-saudáveis ​​(vermelho) e uma cultura SCN que secou (azul) após a abertura da placa de cultura selada no dia 4 e não re-selar o prato de forma adequada ( indicado pela seta). Figura 4. Gravação de bioluminescência durante e após exposição à droga. PER2:: LUC expressão em uma cultura de antes, durante e após a ação de um bloqueador dos canais de HCN (ZD7288, 10 mM). A primeira seta indica o momento em que o bloqueador foi adicionado. A segunda seta indica washout, que foi feita através da substituição do medicamento contendo meio com meio controle condicionado. Observe a amplitude reduzida após dois dias de exposição à droga, a falta de oscilação nos dias 4 e a rápida recuperação do ritmo de proteína após a lavagem.