Expansion ex vivo des cellules tumorales T-réactive par le moyen de 1/Ionomycin Bryostatine et la chaîne gamma commune cytokines Formulation
Summary
Un protocole efficace pour la<em> Ex vivo</em> Extension de cellules T réactives tumeur des ganglions lymphatiques drainant la tumeur ou d'autres tissus lymphoïdes secondaires porteurs de tumeurs hôtes est décrite. Ce protocole étend sélectivement les cellules T spécifiques de la tumeur pour une utilisation en immunothérapie adoptive du cancer du sein.
Abstract
Il a été rapporté que les patients du cancer du sein ont pré-existante des réponses immunitaires contre leurs tumeurs 1,2. Cependant, ces réponses immunitaires ne parviennent pas à fournir une protection complète contre le développement ou la réapparition du cancer du sein. Pour surmonter ce problème en augmentant la fréquence des cellules T réactives tumeurs, immunothérapie adoptive a été employé. Une variété de protocoles ont été utilisés pour l'expansion des cellules T spécifiques de la tumeur. Ces protocoles, cependant, sont limités à l'utilisation d'antigènes tumoraux ex vivo pour l'activation des cellules T spécifiques de l'antigène. Très récemment, la chaîne gamma commune des cytokines comme l'IL-2, IL-7, l'IL-15 et IL-21 ont été utilisés seuls ou en association pour l'amélioration de l'anti-tumorale des réponses immunitaires 3. Toutefois, il n'est pas clair ce que la formulation serait le mieux pour l'expansion des cellules T réactives tumeur. Nous présentons ici un protocole pour l'activation sélective et l'expansion de la tumeur des cellules T réactives à partir du modèle de souris transgénique FVBN202 de carcinome mammaire HER-2/neu positifs pour une utilisation en thérapie cellulaire adoptive T du cancer du sein. Le protocole inclut l'activation des cellules T avec bryostatin-1/ionomycin (B / I) et l'IL-2 en l'absence d'antigènes tumoraux pour les 16 heures. B / Je activation imite signaux intracellulaires qui aboutissent à l'activation des cellules T en augmentant la protéine kinase C et de l'activité intracellulaire de calcium, respectivement 4. Ce protocole active spécifiquement les cellules T spécifiques de la tumeur tout en tuant les cellules T non pertinentes. Les cellules B / I-T activées sont cultivées avec de l'IL-7 et IL-15 pendant 24 heures puis pulsé avec de l'IL-2. Après 24 heures, les cellules T sont lavés, split, et cultivé avec de l'IL-7 + IL-15 pour les 4 jours supplémentaires. L'efficacité de tumeur spécificité et anti-tumorale des cellules T ex vivo élargi est déterminé.
Protocol
Discussion
L'expansion sélective des cellules T tumeur réactive avec effecteur la fonction anti-tumorale peut être réalisé en utilisant le protocole proposé B / I d'activation et l'expansion ex vivo avec des cytokines chaîne gamma IL-2, IL-7 et IL-15. Alors que l'IL-2 est un facteur de croissance des cellules T qui peuvent soutenir la différenciation et l'expansion des cellules T spécifiques de l'antigène, l'IL-7 peut inhiber l'apoptose des cellules T et le soutien de leur viabili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01 CA104757 (MH Manjili). Nous tenons à souligner l'appui de la VCU Massey Cancer Center et la Fondation du Commonwealth pour la recherche sur le cancer.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bryostatin 1 | Sigma | B7431-10ug | ||
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | ||
| Mouse IL-7 | PeproTech | 217-17 | ||
| Mouse IL-15 | PeproTech | 210-15 | ||
| Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | ||
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | ||
| FBS | Gemini | 100-106 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | ||
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | ||
| β- mercaptoethanol | Sigma | M7522 | ||
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | ||
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Pharmingen | 556547 | ||
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | ||
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | ||
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | ||
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | ||
| formaldehyde | Polysciences | 04018 | ||
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | ||
| Light microscope | VWR | V200073 | ||
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Pharmingen | 555138 | ||
| Cell culture flasks | Greiner | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
