Summary

توسيع فيفو السابقين الخلايا T ورم التفاعل من قبل وسائل 1/Ionomycin Bryostatin وصياغة سلسلة غاما المشتركة السيتوكينات

Published: January 14, 2011
doi:

Summary

بروتوكول للكفاءة<em> خارج الحي</emيوصف> التوسع في ورم الخلايا التائية التفاعل من ورم الغدد الليمفاوية تجفيف أو غيرها من الأنسجة اللمفاوية الثانوية الحاملة للورم المضيفين. يوسع هذا البروتوكول بشكل انتقائي خلايا T للورم محددة لاستخدامها في العلاج المناعي بالتبني من سرطان الثدي.

Abstract

أفادت الأنباء أن مرضى سرطان الثدي قد موجودة مسبقا الاستجابات المناعية ضد الأورام 1،2 بهم. ومع ذلك ، فشلت هذه الاستجابات المناعية لتوفير الحماية الكاملة ضد تطوير أو تكرار الاصابة بسرطان الثدي. للتغلب على هذه المشكلة عن طريق زيادة وتيرة ورم الخلايا التائية التفاعل ، واستخدمت العلاج المناعي بالتبني. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من البروتوكولات لتوسيع خلايا الورم T – معينة. هذه البروتوكولات ، ومع ذلك ، وتقتصر على استخدام المضادات الورم فيفو السابقين لتنشيط خلايا T مستضد محدد. قريب جدا ، وقد استخدمت المشتركة السيتوكينات سلسلة غاما مثل IL – 21 IL – 2 ، IL – 7 ، IL – 15 ، وحدها أو في تركيبة من أجل تعزيز مكافحة الورم الاستجابات المناعية 3. ومع ذلك ، فإنه ليس واضحا ما سيعمل أفضل صياغة لتوسيع خلايا الورم T التفاعل. هنا نقدم بروتوكولا لتفعيل انتقائية وتوسيع التفاعل ورم الخلايا التائية من نموذج FVBN202 الماوس المعدلة وراثيا من سرطان الثدي HER-2/neu إيجابية للاستخدام في علاج الخلايا T بالتبني من سرطان الثدي. البروتوكول يتضمن تنشيط خلايا T مع bryostatin-1/ionomycin (B / I) و IL – 2 في غياب مستضدات الورم لمدة 16 ساعة. B / I التنشيط يقلد الاشارات بين الخلايا التي تؤدي إلى تنشيط الخلايا T عن طريق زيادة نشاط البروتين كيناز سي والكالسيوم داخل الخلايا ، على التوالي 4. هذا البروتوكول على وجه التحديد ينشط الخلايا T – ورم معين في حين قتل خلايا T لا صلة لها بالموضوع. يتم تربيتها في B / I – تنشيط خلايا T مع IL – 7 و IL – 15 لمدة 24 ساعة وبعد ذلك مع نابض IL – 2. بعد 24 ساعة ، ويتم غسل الخلايا التائية ، تقسيم ، والمثقف مع IL – 7 + IL – 15 ليوم 4 إضافية. يتم تحديد فعالية وخصوصية للورم المضادة للورم في خلايا الجسم الحي السابقين T الموسعة.

Protocol

1. عزل الخلايا اللمفاوية 5 ورم الغدد الليمفاوية عزل تجفيف أو الطحال من الفئران الحاملة للورم FVBN202 المعدلة وراثيا وإعداد وحيدة الخلية في تعليق الجليد الباردة RPMI1640 تستكمل مع FBS 10 ٪. B / I التنشيط في 50 مل من أنابيب البو?…

Discussion

ويمكن تحقيق التوسع الانتقائي للورم خلايا تي التفاعل مع وظيفة مضادة للورم المستجيب من البروتوكول المقترح باستخدام B / I التنشيط وبحكم التوسع المجراة مع السيتوكينات سلسلة غاما IL – 2 ، IL – 7 و IL – 15. بينما IL – 2 هو عامل نمو الخلايا التائية التي يمكن أن تدعم التمايز وا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة CA104757 المنحة R01 (MH Manjili). نحن نعترف بامتنان دعم مركز سرطان سي يو ماسي ومؤسسة الكومنولث للبحوث السرطان.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bryostatin 1   Sigma B7431-10ug  
Ionomycin   Calbiochem 407950  
Mouse IL-7   PeproTech 217-17  
Mouse IL-15   PeproTech 210-15  
Human IL-2   PeproTech 200-02  
RPMI1640   Invitrogen 11875  
FBS   Gemini 100-106  
Penicillin/Streptomycin   Cellgro 30-002-CI  
L- glutamine   Invitrogen 25030081  
β- mercaptoethanol   Sigma M7522  
anti-CD16/32 antibody   Biolegend 101302  
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit   BD Pharmingen 556547  
FITC-CD4   Biolegend 100406  
PE-CD8   Biolegend 100708  
anti-c-Erb2/c–Neu   Calbiochem OP16  
PE- anti mouse IgG   Biolegend 405307  
formaldehyde   Polysciences 04018  
Hemocytometer   Hycor 87144  
Light microscope   VWR V200073  
Mouse IFN-γ ELISA set   BD Pharmingen 555138  
Cell culture flasks   Greiner 658175  

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

View Video