Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

1. La preparación de partículas magnéticas anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado (Dynabeads) Prepare un 0,1% de BSA en PBS mediante la mezcla de 50 mg de BSA en 50 ml de PBS con un agitar hasta BSA se disuelve. Esterilizar por filtración a través de filtro de 0,22 micras jeringa. Almacenar a 4 ° C. En la capilla de cooperación técnica, transferencia de 200 l de bien resuspendido de oveja anti-ratón IgG Dynabeads en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y lavar los granos: el tubo de montaje en la MPC y deje reposar durante 1 minuto para permitir que los granos de sedimento. Aspirar el sobrenadante, retire el tubo de MPC y volver a suspender las bolas en 1 ml de agua estéril 0,1% de BSA / PBS. Pipeta de arriba y abajo para volver a suspender las bolas. Repetir el lavado tres veces más, para un total de cuatro lavados. Sacar el tubo del MPC y volver a suspender las bolas en 500 l de 0,1% de BSA / PBS. Añadir 10 l de rata anti-ratón de PECAM-1 (CD-31) del anticuerpo en el tubo. Caída la noche a 4 ° C en la cámara frigorífica o 2 horas a temperatura ambiente. Lavar los granos con agua estéril 0,1% de BSA / PBS como se describe en el paso 1.2 en cuatro ocasiones. Sacar el tubo del MPC y volver a suspender las bolas en 200 l 0,1% de BSA / PBS. Tienda anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado con Dynabeads a 4 ° C durante un máximo de un mes. 2. Aislamiento de ratón las células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos Antes de proceder con el protocolo de purificación de los tejidos, IACUC aprobación del Comité del procedimiento es necesario. Prepare las siguientes: 15 ml de 1 mg / ml C / D solución en DMEM. Filtro con filtro de 0,22 micras jeringa y calentar a 37 º C. Tubo de 50 ml cónicos con 15 ml de DMEM, almacenar en el hielo Aislamiento de los medios de comunicación (mensajería instantánea), que contiene 20% de SFB y la penicilina 1x / estreptomicina en DMEM 2% de gelatina. Mezcla de 2 g de piel de bovino de gelatina con 100 ml de agua dd, minuto 15 autoclave y almacenar a 4 ° C. Calentar a 37 ° C para licuar antes de pintar frascos TC. Anestesiar a tres crías de 6-8 días de edad con una inyección ip de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Comprobar la efectividad de la anestesia y la disección de los animales uno por uno, de la siguiente manera: Pin cachorros a bordo, empape la piel con etanol 70% y eliminar la piel de la zona del pecho con unas tijeras de disección estéril. Impuestos Especiales de la caja torácica para exponer los pulmones. Lóbulos individuales asépticamente especial de pulmón, teniendo cuidado de no analizar los bronquios y los tejidos conectivos visible alrededor de los pulmones. Combine todos los pulmones en helado de DMEM. La eutanasia a los cachorros. De trabajo en la campana TC, remueva los lóbulos pulmonares de DMEM, el lugar en un plato de 100 mm TC y aspirar el exceso de DMEM. Utilizando tijeras estériles, carne picada finamente el tejido mediante la reducción de ~ 100 veces. Traslado a 15 ml caliente C / D solución para la digestión enzimática. Incubar 45 minutos a 37 ° C en un rotor. En la capilla TC, aspirar la suspensión de tejidos digeridos en una jeringa de 20 ml con 14 g grupos cánula unida y triturar en una suspensión de células individuales, por lo menos 12 veces. Pase la suspensión de tejido a través de un filtro de 70 micras de células y lavar el filtro con 15 ml de mensajería instantánea para detener la digestión. Pellet suspensión de células por centrifugación a 400x g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 3 ml de 0,1% de BSA / PBS. Transferencia de suspensión de células a 5 ml tubo de poliestireno de fondo redondo y añadir 22,5 l anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado-Dynabeads. Caída en la temperatura ambiente durante 12 minutos. Cubra un frasco T75 con 2 ml de 2% de gelatina y el exceso de aspirado de gelatina. Permita que la gelatina seca en su interior la capilla TC durante unos 30 minutos antes de las células de revestimiento. Después de la incubación de cuentas es completa (paso 2,10), dividir la suspensión de células por igual en tres tubos Eppendorf y se montan en el MPC. Cuando las cuentas se han sedimentado con el MPC (~ 1 minuto), recoger el líquido sobrenadante, retire el tubo de la MPC, lavar los granos con aproximadamente 1 ml 0,1% de BSA / PBS, y volver a montar en el MPC. Repetir el lavado cuatro veces (un total de 5 lavados) Cuentas resuspender en 1 ml de VascuLife con ENG-Mv vida Factores de Kit y 1 de penicilina / estreptomicina (VL) por tubo, se mezcla bien. Placa en una pre-recubiertos T75 frasco y alcanzar un volumen total en cada frasco de 10 ml a la LV. Cambiar los medios de comunicación al día siguiente, deje un día lleno de crecimiento, y luego cambiar la mitad de los medios de comunicación todos los días. Cuando las células son> 70-80% confluentes o más (por lo general después de 3-4 días de la cultura), que pueden ser ordenados con anti-ICAM-2 Dynabeads. 3. La preparación de anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado Dynabeads Dynabeads anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado se utiliza para purificar las células que han sido seleccionados con anti-PECAM-1 Dynabeads anticuerpos conjugados y cultivaron hasta confluencia. Este procedimiento se realiza como se describe para Dynabeads anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado (1, arriba), excepto que el anti-ratón ICAM-2 (CD-102) del anticuerpo se utiliza en lugar de anti-PECAM-1 anticuerpo. Dynabeads anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado se puede almacenar a 4 ° C hastaa 1 mes. 4. Clasificación de las células de ratón de pulmón endoteliales con anticuerpos anti-ICAM-2 Dynabeads Escudo T75 frasco de cultivo de tejidos con gelatina al 2%. Aspirar los medios de comunicación de la confluencia con el T75 frasco con células y lavar con 8 ml de PBS. Aspirar PBS, añadir 2 ml al 0,05% de tripsina / EDTA y dejar que las células de quitar (unos 5 minutos). Toque en frascos ligeramente para ayudar a separar. Cuando las células se han desprendido, añadir 2 ml IM para inhibir las células de la tripsina y la raspadura de separar las células adherentes restantes. Transferencia de suspensión de células a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 minutos a 400 veces g. Aspirar los medios de comunicación y resuspender el sedimento celular en 2 ml de 0,1% de BSA / PBS. Transferir a un 5 ml de poliestireno de fondo redondo de tubo y se añaden 10 l anti-ICAM-2 Dynabeads. Caída por 12 minutos a temperatura ambiente. Dividir la suspensión de células en dos tubos de 1,5 ml Eppendorf y se montan en MPC. Aspirar el sobrenadante después de cuentas se han adherido durante un minuto. Retire los tubos del MPC y resuspender en cada tubo 1 ml 0,1% de BSA / PBS. Vuelva a colocar el MPC. Repetir el lavado cuatro veces (un total de 5 lavados). Resuspender cada tubo con 1 ml VL y realizar un recuento de células. Células de la placa a 250-350K células por frasco T25 y / o 750K-1 millón de células por frasco T75. Alcanzar un volumen de 5 ml VL en frascos T25, y 10 ml en frascos T75. Cambiar los medios de comunicación todos los días. Las células pueden ser utilizados para los experimentos en que la cultura llega a cerca del 80% de confluencia, por lo general en 2-3 días. 5. Resultados representante Normalmente, después de 6-7 días a partir de la preparación inicial de las células, que son capaces de obtener unos 1,2 a 1,5 x 10 6 células endoteliales pulmonares de tres crías de 6-8 días de edad. Células típicos de la pantalla "adoquines" morfología con microscopía de luz y VE-cadherina (CD144) manchas en las uniones célula-célula, que es característico de las células endoteliales (Figura 1). La mayoría de los MLECs expresa VE-cadherina y VEGFR2 como lo demuestra el análisis de FACS (Figura 2). Por lo general, los utilizamos para los experimentos dentro de dos semanas después de la inicial de aislamiento LMCE. Figura 1. El análisis microscópico de monocapa confluente LMCE. (A) Imagen de microscopía de luz muestra la morfología de las células cultivadas empedradas típicas de las células endoteliales. Uniforme de estructuras redondas ubicadas en la zona perinuclear de las células son muchas las partículas magnéticas utilizadas para el aislamiento LMCE. (B) endotelial específico VE-cadherina se localiza en las uniones célula-célula, como se muestra mediante microscopía confocal. Bar es representante de 20μm. Figura 2 FACS análisis de MLECs cultivadas con anticuerpos específicos para los marcadores específicos del endotelio:. VE-cadherina (CD144) o VEGFR2, como acusado, seguido por ficoeritrina-anticuerpo secundario conjugado, confirma la identidad del endotelio de MLECs aislados. La línea roja indica isotipo específico de control, la línea verde indica anti-VE-cadherina o anti-VEGFR2 – específicos IgG.