末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養
Summary
我々は、末梢神経突起伸長の栽培とタイムラプスイメージングのための妊娠中期のマウス胚の器官型スライスを準備する方法を提示する。
Abstract
多くの目的のために、器官型スライスなどのマウス胚のex vivoでの栽培が望ましいです。例えば、我々は両方のフィルムの神経支配の可能性をできるように、緑色蛍光タンパク質（EGFP）の拡張版を独占的に開発し、中枢および末梢神経系1のすべてのニューロンに発現するトランスジェニックマウスのライン（tauGFP）を採用前肢および薬理学的および遺伝学的手法2でこのプロセスを操作する。このようなスライス培養の成功した栽培で最も重要なパラメータは、スライスが準備される方法です。種々の方法の広範なテストの後、我々は、ビブラトームは、彼らが日常的に数日間の期間にわたって実行可能性を示す文化につながるような胚をスライスする最良のデバイスであり、そして最も重要なことは、年齢で発症することを見出した固有の方法。妊娠中期胚の場合、これは脊髄および後根神経節から周囲と骨格と筋肉組織の適切な決定で、その目標への脊髄神経の正常な伸長を含みます。
スライス標本の後二日するまで学ぶことができる標準的な組織培養インキュベーター、栽培は400マイクロメートルのスライス – この作品では、我々は300に（E）E10 E12に日胚の全胚を処理するための手法を提案する。このアプローチの成功のための重要な各アガロース包埋の胚をスライスするビブラトームを使用することがあります。これは、インタフェースの培養技術で、その結果中小の小さな体積に課せMillicell文化膜インサート、時のスライスの栽培が続いている。 7胚の平均で一リットルは、日常的にわずかに胚の年齢までだけでなく、スライスの厚さにより変動する少なくとも14スライス（胚あたりの前肢地域の2-3スライス）を生成する。培養スライスの約80％が培養期間2 througout測定可能な神経突起伸長を、示す。 tauGFPのマウスラインを用いて代表的な結果が実証されています。
Protocol
Discussion
妊娠中期のマウス胚の胚切片培養（E10 – E12）を調製する方法の広範な比較では、我々はビブラトームは質問なしでの文化の全体的な実行可能性との再現性の両方に関して最も信頼性の高い結果を生じることを観察した神経突起伸長のパターン。対照的に、マッキルウェーン組織チョッパ3を用いて調製したスライスは、完全に生存不能であることが判明した。私たちは、もともと?…
Acknowledgements
著者らは、マウス胚5時切片培養を行うためにアイデアの元のソースを認めます。私たちは、撮影中に私たちの使い走りとして機能するために寛大な科学的なサポートとアンナデジャンためのヨアヒムキルシュに感謝します。とハイデルベルク大学（エクセレンスクラスターセルラーネットワーク）：この作品は、ドイツ研究協会（Sonderforschungsbereich 488、Teilprojekt B7/B9ドイツ学術振興）によって賄われていた。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
| Dissection tools | FST | various | ||
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
| Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
| Shortened firepolished pipettes | ||||
| DMEM | GIBCO | 41966 | ||
| FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
| Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
| L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
| Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
| Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
| analySIS | Soft Imaging System | |||
| Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
| LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
| Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
| HEPES | Roth | 9105.2 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| x4 objective | Olympus | PL series | ||
| x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
| Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
| Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
