Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ Hibridizasyon Salmonella Taze üretin
Summary
Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım, açıklar<em> Salmonella</em> Floresan kullanarak<em> In situ</em> Hibridizasyon (FISH).
Abstract
Bu protokol, domates ve diğer taze ürün yüzeyleri yapışkan bant tabanlı örnekleme bant floresan in situ hibridizasyon (FISH) Salmonella spp hızlı kültür-bağımsız tespiti için takip için basit bir yaklaşım açıklanmıştır . Hücre ücret bantları da algılama önce katı faz zenginleştirme için seçici agar yüzü aşağı yerleştirilmiş olabilir. Alternatif olarak, düşük hacimli sıvı zenginleşmesi (sıvı yüzey miniculture), akım sitometri analizi ile FISH ve non-selektif suyu bant yüzeyi, yapılabilir. Başlamak için, steril yapışkan bant, taze ürün ile temas getirilen hafif basınç uygulanır ve bant fiziksel olarak bu yüzeyler üzerinde bulunan mikropların açılan kaldırılır. Bantlar cam mikroskop lamı üzerine yapışkan yüzü yukarı monte edilip edilmediğini ve örneklenen hücrelerin% 10 formalin (30 dk) ve kurutulmuş kademeli etanol serisi (50, 80, ve% 95; 3 dakika Her konsantrasyon) ile sabittir. Sonra, hücre ücret bantları Salmonella hedefli DNA prob kokteyl içeren tampon ile tespit ve 15 melezleşmiştir – 55 30 dk ° C, kısa bir bağlanmamış prob kaldırmak için bir çamaşır tamponunda durulama takip. BALIK-etiketli hücreleri, yapışkan sonra floresan mikroskopi kullanılarak izlenebilir boya 4 DNA ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve sonuçları ile zıt olan. Katı faz zenginleşmesi için uygun bir seçici agar yüzeyinde, hücre ücret bantlar yüzü aşağı yerleştirilir ve yukarıda açıklandığı gibi, FISH ve mikroskopi takip Salmonella mikrokoloniler yerinde büyüme izin inkübe . Sıvı yüzey miniculture için, hücre ücret bantlar yapışkan tarafına yerleştirilir ve silikon perfüzyon odasının uygulanır, böylece bant ve mikroskop lamı formu, su geçirmez bir odasına alt Triptikaz Soya küçük bir hacmi (≤ 500 mcL) Broth (TSB) tanıtıldı. Giriş çıkış portları kapalı ve odaların 35 inkübe – 37 ° C, teyp çıkarılan mikropların büyüme tabanlı amplifikasyon sağlar. Inkübasyon sonrasında, giriş portları kaplanmadan, hücreler müstakil ve karışık kuvvetli geri ve ileri pipetleme, santrifüj yoluyla hasat ve% 10 oranında sabit nötr tamponlu formalin. Son olarak, örnekler melezleşmiştir ve Salmonella spp varlığını ortaya çıkarmak için akım sitometri yöntemiyle incelenir . Burada açıklandığı gibi, "tape-FISH" yaklaşımı domates yüzeylerde, basit ve hızlı bir örnekleme ve Salmonella algılama sağlayabilir. Ayrıca, ıspanak ve jalapeño biber taze ürünler de dahil olmak üzere diğer türleri, örnekleme için bu yaklaşım kullandık.
Protocol
Discussion
Basit ve hızlı yöntemler üretmek yüzeylerin patojenlerin saptanması için zamanında ve aksiyona yönelik veri sağlayan gıda kaynaklı hastalık azaltılmasına yardımcı olabilir. 1950'lerden beri, çevre klinik ve gıda mikrobiyolojisi Yapıştırıcı bant tabanlı örnekleme yöntemleri kullanılabilir ve direkt mikroskobik inceleme ya da için sağlam bir medya yapışık mikroorganizmalar transferi, mikroorganizmaların giderilmesi için yüzeylere "Scotch" tarzı kaset basarak dahil edilmi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BFBS bir Iowa Değerler Büyüme Fonu ödülü tarafından bu iş için finansman sağlanmıştır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
| Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
| Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
| Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
| Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
| Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
| Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
| Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
| Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
| Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
References
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
- Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. Skin sampling for Candida with adhesive tape. Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system. Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).
- Edwards, R. W., Hartman, E. A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces. Lloydia. 15, 39-39 (1952).
- Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. Microbiological monitoring of the food processing environment. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).
- Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces. J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).
- Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).
- La Cono, V., Urz, C. Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips. J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).
- Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations. Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).
- Langvad, F. A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves. Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).
- Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).
