粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

このプロトコルは、 サルモネラの迅速なカルチャに依存しない検出のためのin situハイブリダイゼーション（FISH） でオンテープ蛍光続いてトマトや他の生鮮食品の表面の粘着テープベースのサンプリングのためのシンプルなアプローチを、説明します。セル充電されたテープは、検出前に固相濃縮のための選択寒天培地に直接フェースダウンに配置することができます。また、少量の液体富化（液面のminiculture）はフローサイトメトリーを経由してFISHと分析に続いて、非選択培養液中のテープの表面に行うことができます。開始するには、無菌の粘着テープが新鮮な農産物と接触させ、物理的にこれらの表面上に存在する微生物を抽出し、穏やかな圧力が適用され、テープが削除されます。テープは、顕微鏡用スライドガラスの上にまで粘着側にマウントされ、サンプリングされた細胞を、10ホルマリン％（30分）と段階的エタノールシリーズを用いて脱水（50、80、および95％、3分ごとの濃度）で固定されています。次に、細胞に帯電したテープは、 サルモネラをターゲットとしたDNAプローブのカクテルを含むバッファーでスポットし、15でハイブリダイズさせる- 55℃で30分間、非結合プローブを除去するための洗浄バッファーでリンス短いが続く。接着、FISH -標識細胞は、蛍光顕微鏡を使用して表示しているDNA色素4',6 -ジアミジノ-2 – フェニルインドール（DAPI）との結果で対比されています。固相濃縮するために、細胞に帯電したテープは、適当な選択寒天の表面に直接フェースダウン配置され、 サルモネラ microcoloniesのその場成長に許可するようにインキュベートし、上記のようFISHと顕微鏡が続きます。液面minicultureの場合は、セルに帯電したテープは、粘着面を上に配置され、シリコン灌流チャンバーが適用されているので、テープや顕微鏡のスライドの形防水チャンバー内の底部トリプチケースソイの小さい容積（≤500μL）ブロス（TSB）が導入されています。入口ポートは封印されており、チャンバーを35℃でインキュベートされる – 37 ° C、テープ抽出した微生物の増殖ベースの増幅を可能にする。インキュベーション後、入口ポートが開封され、細胞が分離し、混合精力的なバックで前後にピペッティング、遠心分離を介して収穫し、10％で固定されている中性緩衝ホルマリン。最後に、サンプルをハイブリダイズし、 サルモネラ属菌の存在を明らかにするためにフローサイトメトリーを介して検査されます。ここで説明したように、私たちの"テープ- FISH"のアプローチは、シンプルかつ迅速なサンプリングとトマトの表面のサルモネラの検出を提供することができます。我々はまた、ほうれん草とハラペーニョペッパーを含む生鮮食品の他のタイプを、サンプリングするためのこのアプローチを使用している。