مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة
Summary
هذا البروتوكول وصف بسيط لاصق الشريط النهج القائم على أخذ عينات من البندورة وغيرها من المنتجات الطازجة السطوح ، تليها السريع كشف الخلية بأكملها<em> السالمونيلا</em> باستخدام مضان<em> في الموقع</em> التهجين (FISH).
Abstract
يصف هذا البروتوكول مقاربة بسيطة لاصق الشريط القائم على أخذ عينات من البندورة وغيرها من المنتجات الطازجة السطوح ، تليها على الشريط مضان التهجين في الموضع (FISH) للكشف عن ثقافة مستقلة السريع لSPP السالمونيلا. ويمكن أيضا أشرطة الخلية مشحونة وضعها وجها لأسفل على أجار انتقائية لالصلبة مرحلة تخصيب اليورانيوم قبل الكشف عنها. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التخصيب المنخفضة حجم السائل (السائل miniculture السطح) على سطح الشريط في غير انتقائي مرق ، تليها الأسماك وتحليلها عن طريق التدفق الخلوي. لتبدأ ، يتم إحضارها معقمة شريط لاصق على اتصال مع المنتجات الطازجة ، يتم تطبيق ضغط لطيف ، وإزالة الشريط ، واستخراج جسديا الميكروبات الموجودة على هذه السطوح. هي التي شنت الأشرطة اللاصقة جانب حتى على الشرائح المجهر والزجاج ، ويتم إصلاح الخلايا عينات مع 10 ٪ من الفورمالين (30 دقيقة) والمجففة الايثانول باستخدام سلسلة متدرجة (50 ، 80 ، و 95 ٪ ؛ 3 دقائق كل التركيز). ورصدت المقبل ، الخلية مشحونة مع الأشرطة العازلة التي تحتوي على السالمونيلا التي تستهدف تحقيق DNA الكوكتيل والمهجنة لمدة 15 — 30 دقيقة عند درجة حرارة 55 مئوية ، يليه موجز شطف الغسيل في منطقة عازلة لإزالة التحقيق غير منضم. ملتصقة ، يتم counterstained ثم الأسماك المسماة الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي صبغ 4 '،6 – diamidino – 2 – phenylindole (دابي) والنتائج يتم عرضها باستخدام المجهر مضان. الصلبة لمرحلة تخصيب اليورانيوم ، وتوضع الخلايا مشحونة الأشرطة وجها لأسفل على سطح آغار انتقائية مناسبة والمحتضنة للسماح للنمو في الموقع من microcolonies السالمونيلا ، تليها الأسماك والمجهري كما هو موضح أعلاه. miniculture عن سطح السائل ، يتم وضع الخلية اتهم الجانب الأشرطة اللاصقة وحتى يتم تطبيق غرفة نضح سيليكون بحيث الشريط وشكل شريحة المجهر الجزء السفلي من الغرفة الضيقة المياه التي في حجم صغير (≤ 500 ميكرولتر) من فول الصويا Trypticase يتم تقديم حساء (TSB). وأغلقت مداخل ومنافذ يتم تحضين الغرف في 35-37 درجة مئوية ، مما يسمح للنمو القائم على التضخيم من الشريط استخراج الميكروبات. التالية الحضانة ، وتفض مدخل الموانئ ، يتم فصل الخلايا ومختلطة مع عودة قوية وpipetting إيابا ، تحصد عن طريق الطرد المركزي والثابتة في 10 ٪ مخزنة محايدة الفورمالين. أخيرا ، يتم تهجين عينات وفحصها عبر التدفق الخلوي للكشف عن وجود السالمونيلا SPP. كما هو موضح هنا ، يمكن لنا "الشريط FISH" نهج تقديم عينات بسيطة وسريعة والكشف عن السالمونيلا على سطح الطماطم. وقد استخدمنا هذا النهج أيضا لأخذ العينات أنواع أخرى من الفواكه والخضروات الطازجة ، بما في ذلك السبانخ والفلفل جالابينو.
Protocol
Discussion
قد أساليب بسيطة وسريعة للكشف عن مسببات الأمراض على السطوح تنتج مساعدة في تخفيف الأمراض المنقولة بالأغذية من خلال تقديم بيانات آنية وقابلة للتنفيذ. وقد استخدمت لاصق طرق أخذ العينات الشريط القائم في مجال الميكروبيولوجيا البيئية والطبية والغذائية منذ عام 1950 وإشراك ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل على جائزة ولاية ايوا صندوق القيم ينمو لBFBS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
| Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
| Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
| Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
| Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
| Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
| Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
| Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
| Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
| Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
References
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
- Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. Skin sampling for Candida with adhesive tape. Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system. Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).
- Edwards, R. W., Hartman, E. A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces. Lloydia. 15, 39-39 (1952).
- Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. Microbiological monitoring of the food processing environment. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).
- Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces. J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).
- Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).
- La Cono, V., Urz, C. Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips. J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).
- Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations. Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).
- Langvad, F. A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves. Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).
- Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).
