Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

1. Assemblée Microendoscope Le microendoscope haute résolution décrit ici (figure 1a) devrait être considéré comme une configuration de base avec plusieurs variations possibles dans l'assemblage et l'application. Nous décrivons en détail ici une réalisation de la plate-forme qui est conçu pour être utilisé avec proflavine comme agent de contraste fluorescents. Proflavine est une brillante tache avec nucléaires pic d'absorption et d'émission de longueurs d'onde de 445 nm et 515 nm, respectivement. L'utilisation d'agents de contraste d'autres auront besoin de l'utilisateur de sélectionner l'excitation, d'émission, et des filtres dichroïques de manière appropriée. Plusieurs éléments de l'microendoscope haute résolution sont génériques et peuvent être obtenus auprès de plusieurs fournisseurs. Par exemple, les composants opto-mécaniques de positionnement sont disponibles à partir Thorlabs, Newport, Linos, entre autres. Compact caméras CCD sont disponibles auprès de sociétés telles que Point Grey Research, Prosilica, et Retiga; sensibilité de la caméra doit être choisi en tenant compte de la luminosité du fluorophore à être utilisé, ainsi que la cadence désirée. Haute puissance des diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être obtenus à partir de Luxeon, des Cris et Nichia, entre autres. Fibre optique faisceaux sont disponibles auprès de Sumitomo, Fujikura, et Schott. Dans la sélection des composants pour une application spécifique, l'utilisateur devrait considérer les relations inhérentes à la microscopie par fluorescence entre la concentration de fluorophore, photoblanchiment, intensité de l'illumination, sensibilité de la caméra, le gain et le temps d'exposition. Branchez le 6 "tiges cage pour les 1,5" tiges cage, pour former une paire de 7.5 "de longues tiges. Vissez ces tiges dans une face de l'unité de miroir pli. Visser le 0,5" tiges dans la face opposée. Faites glisser le cube cage sur les tiges de la cage, en passant par les deux inférieurs à travers les trous. Vissez les deux "tiges dans la face latérale du cube cage (figure 1b). Fixez la caméra sur une plaque de la cage en utilisant une monture C à l'adaptateur SM1. Fixez la plaque sur la cage de 0,5 tiges cage », affleure la face de l'unité de miroir pli. Insérez le «tube» dans une lentille de 3 "lentille de tube long et sécuriser l'objectif avec une bague de retenue. La longueur focale de l'objectif doit être choisie de telle sorte que les noyaux du faisceau de fibres optiques sont échantillonnés par au moins deux pixels lors de la projection sur la caméra. Déposer le filtre d'émission dans le tube au-dessus du premier anneau de retenue et ajouter une autre bague pour fixer le filtre en place. Respectez la convention d'orientation du filtre indiqué par le fabricant du filtre. Vissez la lentille de tube sur le côté de la cube de la cage la plus proche de la caméra CCD. Notez que dans la figure 1c, cette lentille et le filtre sont présentés sans le tube 3 lentilles "pour plus de clarté. Connectez l'appareil à un ordinateur et afficher l'image sur l'écran. Diriger l'ensemble cage à un objet lointain et faites glisser le cube en cage le long des rails jusqu'à une image apparaît au point. Verrouiller le cube en cage à cet endroit. (Ceci est une méthode simple de s'assurer que la lentille de tube forment une image focalisée lorsqu'il est combiné avec l'infini-corrigés objectif). Insérez le miroir dichroïque dans le support et le lieu à 45 ° dans le cube en cage. Vissez la lentille de l'objectif, via une RMS pour SM1 adaptateur de filetage et d'un tube lentille réglable, à la face du cube en cage en face de la porte-lentille de tube. Un z-traducteur peut être utilisé à la place du tube de lentille réglable pour faciliter la mise au point. Vis un connecteur SMA dans une plaque de cage et de monter ce sur les tiges, approximativement à la distance de travail de l'objectif. Monter une LED sur une plaque en cage et glisser sur la fin de la 2 "barres. Ajouter une lentille à un 0,5" tube d'objectif tel que, lorsque ce tube est vissé dans le côté du cube en cage, il va former une image de la LED qui remplit l'ouverture arrière de l'objectif. Cette configuration (éclairage de Köhler) fera en sorte que la face proximale du faisceau de fibres optiques est uniformément éclairé. Ajouter le filtre d'excitation dans le tube 0,5 lentilles "et fixer en place avec un anneau de retenue (figure 1c). Attachez un connecteur SMA à un faisceau de fibres optiques. Vissez le bundle SMA connectorisés dans le réceptacle de SMA montés sur les tiges de la cage. Direct de l'extrémité distale du faisceau vers une source lumineuse à large bande (éclairage fluorescent suffira) et d'observer l'image du visage bundle proximale sur la caméra CCD. Ajustez la position de la lentille de l'objectif en vissant ou en dehors du cube cage jusqu'à ce que l'image apparaît dans faisceau de fibres de discussion. Les noyaux individuels devraient être clairement visibles (figure 2). 2. Assemblée Objectif GRIN La résolution spatiale de l'microendoscope peut être augmentée en ajoutant un micro-lentille ou d'assemblage de lentilles à l'extrémité distale du faisceau de fibres. Ces optiques sont configurés de telle sorte que, au lieu de placer la pointe bundle directement sur le tissu, la pointe est reflétée sur la surface du tissu avec démagnification, augmentant ainsi la fréquence d'échantillonnage spatiales imposées par le GUID lumièreING noyaux du faisceau de fibres. Le degré de démagnification correspond à l'augmentation de la résolution spatiale, et dans le même temps, à une diminution proportionnelle dans le champ de vision. Composants lentilles à gradient d'indice (GRIN) sont compatibles avec la fibre optique et sont disponibles à partir GrinTech, NSG, Schott, entre autres, et peut être directement lié à l'extrémité distale d'un faisceau de fibres. Sélectionnez une lentille GRIN avec le grossissement désiré et la distance de travail pour votre application. S'assurer que le diamètre de la lentille est supérieure à celle du faisceau de fibres que vous prévoyez de travailler avec. Nous recommandons que le faisceau de fibres et de lentilles GRIN être monté sur 3 axes séparés platines de positionnement manuel sous un microscope de faible puissance ou stéréoscope pour un alignement précis avant le collage. Déposer une goutte de colle optique (par exemple, Norland adhésifs UV) sur la lentille ou le visage bundle. Apportez les deux composantes en contact en utilisant les positionneurs manuel. Exposer l'interface à la lumière UV pour la dose recommandée par le fabricant. Pour protéger la lentille GRIN et l'interface collés, une courte longueur de tube d'aluminium capillaire (petites pièces Inc) peut être utilisé pour enfermer l'articulation. Faites glisser le tube sur le joint et fixer en place à l'époxy. Gaine thermorétractable peut être utilisée pour terminer l'assemblage. 3. Imagerie Microendoscope Appliquer l'agent de contraste pour les cellules ou les tissus à imager. Avec proflavine (0,01% p / v dans du PBS), dans l'imagerie in vitro des cellules en culture peut être effectuée par une brève incubation (<1 minute) et un rinçage complet. Imagerie des spécimens de tissus ex vivo ou in vivo dans les tissus est possible après l'application topique de la teinture. L'absorption de proflavine dans ces conditions, a été trouvé pour être quasi instantanée, avec l'imagerie possible en quelques secondes et durable pendant plusieurs minutes. Placez le faisceau de fibres optiques en contact léger avec l'échantillon à imager. Lorsque les cellules d'imagerie dans la culture ou ex vivo des échantillons de tissus, nous recommandons le montage de l'extrémité distale du faisceau de fibres dans un dispositif de sécurité avec des étapes de positionnement manuel sur les axes XYZ pour la stabilité pendant l'imagerie. 4. Les résultats représentatifs: Une fois assemblé correctement, le microendoscope fonctionnera comme un microscope à épifluorescence, relayée par une stratégie cohérente de fibre optique bundle. Pour des résultats optimaux d'imagerie, l'attention devrait être accordée pour s'assurer que trois conditions principales sont remplies: La face proximale du faisceau de fibres devrait être imagés sur la caméra CCD sans défocalisation, afin de parvenir à la résolution complète du système. Figure 2a, b, c montrent une partie d'un faisceau de fibres imagé avec un accent pauvres, défocalisation légère, et se concentrer bonne, respectivement. L'accent est optimale en ajustant la position axiale de la lentille de l'objectif relativement à la face bundle. La face proximale du faisceau de fibres doivent être uniformément éclairée sur son plein diamètre (champ de vision). Comme décrit dans le texte du Protocole (1,7), ceci est réalisé en configurant l'optique d'illumination pour l'éclairage de Kohler. Figure 2D montre une image acquise lors d'un échantillon homogène fluorescente est illuminé dans cette configuration préférée, avec la figure 2e démontrant le résultat correspondant sous un éclairage critique. Dans ce dernier cas, la structure de la LED est reflétée sur le visage faisceau de fibres, résultant en l'apparition de ce modèle indésirables superposée à la structure de l'échantillon vrai. Les deux visages proximales et distales du faisceau de fibres doit être propre et exempt de rayures et de copeaux. Figure 2f démontre la présence de débris attachée à la face bundle, avec des dégâts sous la forme d'une petite puce à 5 heures sur le périmètre de la fibre. Les débris peuvent être retirés de la liasse des visages par le nettoyage de la même façon que conventionnelles connecteurs à fibres optiques, avec du papier d'objectif et l'isopropanol, ou des outils standard de nettoyage de fibre optique. Si l'une des extrémités du faisceau de fibres est rayé ou ébréchées, ou si le faisceau des pauses le long de sa longueur, le visage peut être poli à plat par manuel standard, ou des techniques de polissage mécanique. Nous vous recommandons de 12-15 um clapotis de papier pour un poli initial grossier, avec un vernis final sur du papier de 0.5 à 1.0 um. La figure 3a montre l'imagerie de 1483 cellules in vitro, après marquage avec le placement proflavine et la lumière du faisceau de fibres nues sur l'échantillon. Figure 3b montre l'amélioration de la résolution spatiale et la réduction du champ de vision fourni par une lentille GRIN 2.5x collée à l'extrémité bundle. Film 1 montre l'imagerie in vivo de la plaquette mammaires de graisse dans un modèle murin. Ici, un faisceau de fibres avec 0,5 mm de diamètre extérieur (330 um champ de vue) a été passé à travers une aiguille de calibre 21 et avancé dans le tissu. Les cellules adipeuses sont clairement visibles, avec des mouvements dus au cycle cardiaque apparente dans cette acquisition à 15images par seconde. La figure 3c montre l'imagerie de la muqueuse buccale chez un volontaire humain sain, en utilisant cette fois un ensemble plus large en fibre avec 1,5 mm de diamètre extérieur (1,4 mm champ de vue). Dans tous les exemples présentés, proflavine a été utilisé comme un agent de contraste marquage nucléaire fluorescent. Figure 1. Assemblage du microendoscope haute résolution (HRME). Schéma (a) du système HRME. (B) de l'Assemblée de la structure de soutien optomécanique principal. (C) l'ajout d'éléments optiques, éclairage LED, et une caméra CCD. (D) photographie du système HRME, emballé dans un 10 "x 8" x 2,5 "enclos. Figure 2. Configuration du HRME. Des exemples de l'imagerie avec le faisceau de fibres optiques en (a) se concentrent pauvres, (b) à proximité de concentrer une bonne, (c) focalisation idéale. En (d), une cible homogène fluorescente à l'extrémité distale du bundle est imagé dans Kohler (uniforme) d'illumination. (E) un objectif uniforme fluorescente sous un éclairage critique imagée, avec la structure apparente de la source sur l'objet. (F) les tissus en vrac et les cellules peuvent se coller au visage faisceau de fibres, qui est également sujette à des dommages mineurs à sa périphérie. Figure 3. Imagerie avec le HRME. (A) 1483 cellules in vitro, imagé avec un faisceau de fibres nues (IGN-08/30) suivant le marquage avec proflavine 0,01% (p / v). (B) Le même 1483 la culture de cellules, comme indiqué en (a), imagé avec un faisceau de fibres avec une lentille GRIN 2.5x ci-joint. (C) Image de la muqueuse buccale normale humains in vivo, après l'application topique de proflavine 0,01% (p / v). Film 1. Imagerie mammaire de la plaquette en graisse d'un souris via l'insertion d'un diamètre de 450 um faisceau de fibres extérieures dans la lumière d'une aiguille de calibre 21 passés dans le tissu. Proflavine 0,01% (p / v) a été livré sur le site d'imagerie par la même aiguille avant l'insertion de la fibre d'imagerie. Cliquez ici pour visionner la vidéo