Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

1) Hücre Kültürü Ilgi gen eksprese eden hücre türlerini seçin. DNA risk varyantları ve ilgi (Şekil 1) içinde gen transkripsiyonu kodlama polimorfizmi için heterozigot hücre hatları seçin. Kültür tedarikçi özellikleri ise DNA ve RNA ekstraksiyonu için 2 x 10 cm Petri yemekler hazırlamak göre seçilen hücre hatları. Hücrelerin% 80 izdiham aşağıda açıklanan prosedürü izleyerek ya da piyasada bulunan kitler kullanılarak hasat hücrelere prosedürünü başlatmak ve DNA ve RNA izole ulaştığınızda. 2) DNA Ekstraksiyon Çanak ortamları çıkarın, PBS ile yıkayın ve lizis solüsyonu (% 0.6 SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA ve 50 mg / ml RNaz A) çanak 500 mcL ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle hafifçe Rock plaka. ° C 37 gecede bir mikrosantrifüj tüp ve inkübe hücre lizat Pençe. Nihai konsantrasyonu 100 mg / ml proteinaz K ve 37 ° C gecede inkübe. Fenol-kloroform pH 8, tekrar eşit hacmi ile DNA ayıklayın, sonra kloroform / izoamil alkol eşit hacmi ile ayıklayın. 1 / 10 hacim 3 M NaCl ve 2,5 hacim% 100 etanol ile DNA çöktürün. 30 dakika 13.000 rpm'de dönmeye 4, sonra 5 dakika buz bekletin ve ° C DNA% 70 etanol ile yıkayın, hava kuru ve TE 200 mcL tekrar süspansiyon izin verir. 65 ° C'de 10 dakika ve oda sıcaklığında 2 gün bekletin. -20 ° C ya da uzun vadeli ° C 4 Mağaza 3) RNA Ekstraksiyon Çanak ortamları çıkarın, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe TRIzol ve 1 mL PBS ile yıkayın. Pençe hücreler, bir mikrosantrifüj tüp içinde bir kaç kez transfer, pipet ve 5 dakika inkübe edin. 10.000 rpm'de 10 dakika süreyle Spin 4 ° C Taze bir tüp içinde süpernatant transferi ve kloroform 200 mcL ekleyin. Shake ve 10.000 rpm'de 10 dakika için spin 4 ° C Taze bir tüp içinde sulu faz transfer ve% 70 etanol eşit hacmi ekleyin. 1 veya 2 (hacmine bağlı olarak) 30 saniye süreyle maksimum hızda RNeasy sütun ve spin çözüm yükleyin. Burada RNeasy kiti (Qiagen) talimatları takip edin. 4) Nükleik Asit Numune Hazırlama DNA ve RNA konsantrasyonu NanoDrop Spektrofotometre (Thermo Scientific) kullanarak sayısal olarak. Üreticinin talimatlarına göre rastgele decamers ve Üst Simge III Reverse Transcriptase (Invitrogen) kullanarak RNA 500-1000 ng cDNA hazırlayın. 5) PCR ve Primer Eklenti Testi Tasarım iki çift, her DNA markör için PCR primerleri, genomik DNA amplifikasyonu için bir çift ve cDNA için diğer çifti (Şekil 2 ). Ileri yerleştirin ve genomik kirlenmesini önlemek amacıyla farklı ekzonlarında cDNA astar ters. Tasarım aralığı 100-500 bp uzunluğunda bir PCR ürünü elde etmek için astar. 0.5 U Taq Immolase (BioLine) 0.8 mM dNTP, 2 mM MgCl 2, 0.2 M her astar ve cDNA veya DNA ya da 20 ng dahil olmak üzere 10 mcL PCR reaksiyonu hazırlayın. Dört bağımsız reaksiyonlar her numune artırın. PCR amplifikasyon doğrusal faz devir sayısı tutan her bir primer çifti için optimize edilmiş koşullar altında çalıştırın. Eksonükleaz ile PCR ürününün kuluçka fazla PCR primer ve dNTP çıkarın I ve 37 Karides Alkalin Fosfataz (SAP) ° C de 20 dakika. 384 plaka üzerine iki kez her bir PCR ürünü Spot, 8 ölçümleri, her bir örnek için uygun olacağını. Testi Tasarım (Sequenom) yazılımı ile aynı astar genomik ve cDNA PCR ürünleri için kullanılan böylece uzatma astar tasarlayın. 3ddNTPs kombinasyonları (Şekil 2) de dahil olmak üzere 14-18 bp ve uzatma karışımı astar süresini belirtin. Üreticinin talimatlarına göre MassARRAY sistemi (Sequenom) kullanarak astar uzatma reaksiyonu ve MALDI-TOF/MS analiz yürütmek. Tipik bir astar uzatma reaksiyonu bir başlangıç ​​adımı 94 ° C, 2 dakika süreyle, 5 s, 5 s için 52 ° C ve 72 ° C 94 ° C 40 döngüleri takip 5 s. Astar uzatma ürünleri SpectroCLEAN reçine ile temizlenmeli ve SpectroPOINT nanolitre dağıtıcı tarafından mikroarray (chip) üzerine aktarılır. Uzun oligonükleotidler SpectroREADER bir kütle spektrometresi kullanarak MALDI-TOF nicel. 6) İstatistiksel Analiz MALDI-TOF/MS sonuçları deney genel kalitesi için MassARRAY Typer yazılımı ile kontrol edin. Pik alan verileri içeren Allelotyping raporu ayıklayın. Her bir spektrum hesaplamak içinallel 1 ve allel 2 (pik alanına oranı) pik alanı arasındaki oran. 8 ölçümleri arasında, Excel karşılık gelen fonksiyonunu kullanarak, her cDNA örnek için bir pik alan oranı ortalama ve standart sapma kaynaklanıyor. 8 ölçümleri genomik DNA boyunca aynı ortalama pik alan oranı türet. CDNA ortalama oranı, beklenen 1:1 oranında sapma değerlendirmek için genomik ortalama oranı ile bölün. 7) Deneysel Kontrolleri Deneysel eserler ekarte etmek için, deney en az üç kez tekrarlayın. Ek DNA belirteçleri Mümkün olduğunda, tasarım deneyleri. Hem ileri ve geri tellerine tavlama çoklu PCR primer çiftleri ve uzatma primerler tasarlayın. Aldığınızda DNA işaretleyicileri için heterozigot ama fenotipi ile ilişkili DNA risk türevleri yapmamaktadırlar negatif kontroller hücre hatları mümkün testi (Şekil 1 ve 3) 8) Temsilcisi Sonuçlar Kütle spektrometresi izleri örnekler Şekil 3, allel spesifik ifade analizi bir örnek gösterilmiştir. Şekil 4 farklı şablonlar üzerinde yapılan 4 allel spesifik primer uzatma ürünleri analiz sonuçları göstermektedir. Üst grafikler transkripsiyonu kodlama polimorfizmi için heterozigot hem de iki farklı hücre hatları, genomik DNA analizinden elde edilen sonuçlar temsil eder. Ancak, sadece hücre hattı risk DNA varyantı (Şekil 1) için heterozigot. Düşük grafikler aynı hücre hatları elde edilen cDNA analizinden elde edilen sonuçlar temsil eder. Deneysel artifakı bir sonucu olarak ilk zirve, her zaman ikinci bir zirve bile genomik analiz daha yüksek. Bu nedenle, genomik analiz sonuçları cDNA veri normalleştirmek için kullanılır. Normalleştirme sonra, allel oranı anlamlı derecede farklı hücre hattı 1 A (ikinci zirve diğer spektrumları karşılaştırıldığında daha düşük göründüğü), veri bu hücre hattı öneririz B. 1 hücre hattı çok yakın iken A taşır DNA analiz altında gen ifadesi azaltır ikinci zirve ile ölçülen alleli ile faz varyant. Hücre B hattı çok uygun bir negatif kontrol sağlar. Şekil 1. A ve B hücre hattı seçim stratejisi. Hücre dizileri ama sadece hücre hattı risk DNA varyantı (daire) için heterozigot bir transkripsiyonu kodlama işaretleyici (üçgen) heterozigot. Mavi risk varyant allel daha düşük bir seviyede transkripsiyon, (gerçek fonksiyonel varyant ile yakın bir ilişki içinde doğrudan bir etkisi olan ya da ya) ilişkilidir. Şekil 2. Allel özel astar assay uzantısı. Bu rakam cDNA (solda) ve genomik DNA (sağda) şablonları için yapılan deneysel işlemin iş akış göstermektedir. PCR primerleri (gri dikdörtgenler) heterozigot kodlama polimorfizmi (üçgen) yükseltmek için tasarlanmıştır. Genomik kirlenme PCR primerleri amplifikasyon cDNA şablon üzerinde yapılan farklı ekzon (açık mavi bar) yerleştirilir dizileri tavlama önlemek için. PCR ürünü daha sonra polimorfizmi yanında bir baz tavlama bir uzantısı astar ile yürütülen bir astar uzatma reaksiyonu için şablon olarak kullanılır ve üç dideoxynucleotide uygun karışımlar (ddNTPs) sonlandırıcılar (kare) ve bir deoksinükleotid (daire) genişletmek için sırasıyla bir ya da iki temeli astar. Ortaya çıkan astar uzatma ürünleri MALDI-TOF kütle spektrometresi ile ayırma ve miktar izin farklı kitleler var. DNA marker mavi allel karşılık gelen ürün miktarı kırmızı allel nispeten düşüktür. Şekil 3. Allel spesifik bir ifade testinin sonuçları. Rakam genomik DNA üzerinde yapılan analiz kütle spektrometresi sonuçları ve hücre hattı cDNA A ve B hücre hattı (Şekil 1) .