Lenfosit Silahların Yayılmasının Önlenmesi Monitör Carboxyfluorescein diasetat Succinimidyl Ester (KAKE) Kullanımı

1) Reaktif Kurulum 1.1) KAKE stok solüsyonu KAKE boya genellikle 25 mg flakon carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol) olarak satın alınmaktadır. (-20 ° C'de birkaç ay için 50-100 mcL alikotları olarak saklamak) 5 mM nihai bir stok solüsyonu için 8.96 mL DMSO 25 mg çözülür. Depolama sırasında bu tür bir poz kaçınılmalıdır kritik böylece CFDA, SE, sulu çözelti ile reaksiyona girer. 1.2) Lenfositler Farelerin dalak ve lenf düğümleri ile 1 ml kültür ortamı (örneğin RPMI) lenfositlerin yalıtın ve tekrar süspansiyon arasında 0.5 x 10 6 hücre konsantrasyonu ile fetal buzağı serumu (FCS), – 10% 5 ısı ile inaktive edilmiş (HI) x 10 7 / ml. 2) KAKE Etiketleme 2.1) Rutin yöntemi: Dikkatlice taze (ıslatılmış) 10 ml konik tüp alt, orta ve yerin 1 ml hacmi iyice hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. (Islak olmayan bir tüp kullanarak hareketli ve erken CFDA, GD çözümler ile karıştırılarak 1 ml hücre süspansiyonu önleyecektir) tüp yatay yatırın. Hücre çözümü ile temas yapmaz sağlanması tüpün üstündeki plastik olmayan ıslak kısmını dikkatlice PBS 110 mcL ekleyin. 110 mcL PBS CFDA, GD, 5 mM stokunun 1.1 mcL tekrar Hızla tüp kapağı ve çözümleri hızlı üniforma karıştırma almak için de ters ve vorteks. KAKE boya 5 mcM son bir konsantrasyonda olduğunu unutmayın, ancak, optimum konsantrasyonda hazırlanan her parti için belirlenecek, ve ardından etkili olduğundan emin olmak için her 6 ayda bir kontrol. Hücrelerin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. CFDA, SE KAKE dönüştürülmesi üzerine (tartışma) boya, floresan ve böylece aşırı ışığa maruz tarafından beyazlatma eğilimli hale gelir. Bu nedenle, örneğin, alüminyum folyo ile kaplayıp, bu noktadan itibaren tüp ışıktan korumak için tavsiye edilir. Hücreleri, 20 ° C ve süpernatant atarak 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj yoluyla sedimenting, 20 ° C PBS% 5 HI FCS içeren 10 ciltlik seyreltilmesi ile yıkayın. Iki kez daha yıkayın tekrarlayın. (10 daha yüksek hücre sayıları için de uygun olan 2.2) Alternatif yöntem, 30 x 10 7) : 5 mM stok 2 mcL 1 PBS ml ve 1 ml tamamen yeniden süspanse hücrelerin hızlı bir şekilde bu eklentiyi ekleyerek 2 x CFDA (10 mcM), GD çözüm hazırlayın, sonra hızlı bir şekilde tüpün kapağı ve ters ve vorteks almak hızlı üniforma karıştırma. Hücrelerin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve adımları 2.1 (f) ve 2.1 (g) olarak yıkayın. 2.3) Hücreler daha sonra hücre bölünmesi indüksiyonu için bir ilgi protokolü uygulanabilir. Etiketli hücreleri hem de in vitro ve in vivo testleri kullanılabilir. 2.4) yayılması testin bitiminde, hücre hasat ve flow sitometri ile analiz (temsili örnekler için aşağıya bakınız). 3) Temsilci Sonuçlar KAKE seyreltme lenfosit proliferasyonunu değerlendirmek için, bölünmemiş hücrelerinin (yani maksimum floresans) ve olmayan etiketli hücreleri (yani en az floresan) floresan bilmek yararlıdır. Bu nedenle, deney tasarımı, bu kontroller dikkate almalıdır. Aşağıda, in vitro ve in vivo deneylerde flow sitometri CD8 + T hücre bölünmesi ölçmek için KAKE kullanarak örnekler. 3.1 in vitro stimülasyon) Şekil 1 KAKE profilleri gösterir KAKE-etiketli ovalbumin (OVA)-spesifik T hücre reseptörü transgenik OVA çeşitli miktarlarda darbeli dendritik hücreler ile 3 gün kültür sonra CD8 + OT-T hücreleri. CD8 + T hücreleri OT-I farelerin dalak ve lenf düğümleri arınmış KAKE ve 3.3 x 10 4 DC kültürlü 1 x 10 5 hücreleri ile etiketlenir. DC 37 ° C 1 saat için OVA ile darbeli ve kültüre önce iki kez yıkanır. 3 gün sonra, hasat ve etiketli anti-CD8-APC antikorlar ve Hoechst 33.258 ve daha sonra analiz flow sitometri (50.000 olaylar toplanan) hücreler. Live (Hoechst 33.258 -) CD8 + hücreler gösterilmiştir. Etiketli hücre hücre ve sınırlarını tespit hücre bölünmeleri floresan otomatik gösterirken, kontrol grubu olarak, tek başına kültür CD8 + T hücreleri, olmayan bölünen hücrelerden KAKE yoğunluğunu gösterir. 4 KAKE doruklarına, bu örnekte, paneller her hücreleri 3 bölümler uğramadığını belirten görülebilir olduğunu unutmayın. 3.2 in vivo stimülasyon) Şekil 2 transgenik CD8 + OT-T hücrelerinin in vivo olarak 3 gün sonra KAKE etiketli OVA-spesifik T hücre reseptör KAKE profilleri gösterir In 20 mg OVA varlığı. CD8 + T hücreleri CD45.1 congenic OT-I farelerin dalak ve lenf düğümleri arınmış KAKE ve 5 x 10 6 hücre içine iv enjekte C56BL/6J lateral kuyruk ven (CD45.2 +), farelerde ile etiketlenir . , 2 saat fareler sonra 20 mg OVA iv enjekte edildi. 3 gün sonra fareler dalak, anti-B220-PerCP anti-CD8-APC-Cy7 ve anti-CD45.1-PE-Cy7 antikorlar ve Hoechst 33.258 ile etiketlenmiş, bir tek hücre süspansiyonu haline getirilmiş, toplanan ve daha sonra analiz edildi flow sitometri (1.000.000 olaylar toplanan). Live (Hoechst 33.258 -) B220-hücreleri sağ panelde gösterilen sol paneli ve kapılı CD8 + CD45.1 + hücreler gösterilmiştir. Kontrol grubu olarak, unstimulated CD8 KAKE etiketli + T hücreleri, bölünen hücrelerden KAKE yoğunluğunu gösterir olmayan etiketli hücreleri, hücreler ve sınırlarını tespit hücre bölünmeleri otomatik floresan gösterir. CD45 allotypic fark devredilen konak çözme CD8 + T hücreleri, toplam CD8 + T hücreleri (sol panel) küçük bir alt kümesi olarak hayati olduğunu unutmayın. En hücreler hücreleri 6 bölünmelere uğramadığını belirterek, bu örnek (sağ panel) 7 KAKE doruklarına giren unutmayın. Şekil 1. KAKE-işaretli ovalbumin (OVA)-spesifik T hücre reseptör transgenik CD8 Not OVA, farklı konsantrasyonları ile darbeli DC in vitro cevap için + OT-I T hücreleri,, 3 gün kültür sonra gösterilen veriler. CD8 olmayan-bölünmüş nüfus + T yeteneği antijen (açık gri histogram) ve oto-floresan etiketli olmayan nüfus (koyu gri histogram) yokluğunda hücre. Şekil gösteriyor CD8 + T hücreleri, T hücreleri yüksek antijen konsantrasyonlarda bölünmesi, KAKE seyreltme doruklarına göre 1-3 kez bölünmüş var. Şekil 2. Yeteneği KAKE-işaretli ovalbumin (OVA)-özel adoptively OVA için cevap C57BL / 6 farelerinde içine transfer T hücre reseptör transgenik CD8 + OT-I T hücreleri,, evlatlık transferi sonrası 3 gün gösterilen veri Sol paneli:. CD8 +, CD45. alıcı farelerde 1 + OT-1 T hücreleri. Sağ panel: KAKE çoğalması profili. Not CD8 olmayan bölünmüş nüfus + alıcı farelerde T hücreleri antijen (açık gri histogram) ve otomatik olmayan etiketli lenfositleri (koyu gri histogram) floresan almıyor. Şekil KAKE seyreltme doruklarına göre 1-6 kez bölünmüş CD8 + T hücreleri gösteriyor. Şekil 3. Tartışma metin carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDA, SE) ile hücrelerin etiketleme sırasında meydana gelen çeşitli moleküler olayların bir temsili. Süreçle ilgili ayrıntılar için bkz. Not: genel kısaltma 'KAKE' değil, CFDA, SE, genel etiketleme reaktif ve etiketleme işlemi tanımlamak için kullanılır. Parish 4 dayalı Şekil.