Использование карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил Эстер (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов

1) реагента установки 1.1) CFSE маточного раствора CFSE краситель приобрести как карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFDA, SE) (МВт 557,47 г / моль), как правило, в 25 флаконов мг. Растворите 25 мг в 8,96 мл ДМСО для окончательного решения запас 5 мм (50-100 хранить мкл аликвоты при -20 ° С в течение нескольких месяцев). CFDA, SE будет реагировать с водным раствором так важно, чтобы такого воздействия следует избегать во время хранения. 1.2) Лимфоциты Изолировать лимфоциты селезенки и лимфатических узлов или от мышей и ресуспендируют в 1 мл культуральной среды (например, RPMI) с 5% тепла инактивированной (HI) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), при концентрации клеток от 0,5 х 10 6 – 10 х 10 7 / мл. 2) CFSE маркировки 2.1) Рутинный метод: Тщательно ресуспендирования клеток в 1 мл объем среды и места тщательно на дне свежих (не контактирующих с продуктом) 10 мл коническую трубку. Положите трубку горизонтально (с использованием не контактирующих с трубкой будет препятствовать 1 мл клеточной суспензии, от движущихся и преждевременно смешивания с CFDA, решения SE). Аккуратно добавить 110 мкл PBS, чтобы не контактирующих с продуктом части пластик в верхней части трубки обеспечении это не имеет контакта с клеткой решение. Ресуспендируют 1,1 мкл 5 мМ запас CFDA, SE в 110 мкл PBS. Быстро колпачок трубки и инвертировать и вихревые хорошо, чтобы получить быстрый равномерного смешивания растворов. Обратите внимание, что CFSE красителя в конечной концентрации 5 мкМ, однако, оптимальная концентрация, возможно, придется определяться для каждой партии подготовлены, а затем проверять каждые 6 месяцев, чтобы убедиться, что он является эффективным. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре. Обратите внимание, что при преобразовании CFDA, SE, чтобы CFSE (см. обсуждение) краситель становится люминесцентные и, следовательно, склонным к обесцвечиванию под воздействием чрезмерного света. Таким образом, желательно, чтобы защитить от света трубки с этого момента, например, с помощью покрытия из алюминиевой фольги. Вымойте клетки путем разведения в 10 объемах 20 ° C PBS, содержащий 5% HI ФТС, осаждающихся центрифугированием при 300 мкг в течение 5 мин при 20 ° С и отбрасывая супернатант. Повторите мыть два раза больше. 2.2) Альтернативный метод, который также подходит для высших номера сотовых (10 – 30 х 10 7): Подготовка 2 х (10 мкМ) CFDA, SE решение путем добавления 2 мкл 5 мМ акции по 1 мл ФСБ и быстро добавить по 1 мл тщательно ресуспендировали клетки, а затем быстро колпачок трубки и инвертировать и вихревые хорошо, чтобы получить быстрое равномерное перемешивание. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре и мыть как в шагах 2.1 (е) и 2.1 (г). 2.3) Клетки могут быть применены к протоколу, представляющих интерес для индукции клеточного деления. Маркированный клетки могут быть использованы в как в пробирке и в естественных анализов. 2.4) По завершении анализа распространения, клетки собирают и исследуют методом проточной цитометрии (см. ниже представитель примеры). 3) Результаты представитель Для оценки пролиферацию лимфоцитов путем разбавления CFSE, полезно знать, флуоресценция безраздельно клетки (то есть максимальная флуоресценция) и не-меченых клеток (то есть минимальная флуоресценции). Таким образом, ваша опытно-конструкторских должны эти элементы управления во внимание. Ниже приведены примеры в пробирке и в естественных анализов использованием CFSE для измерения CD8 + Т-клеточного деления с помощью проточной цитометрии. 3.1) В стимуляции пробирке На рисунке 1 показана CFSE профили CFSE меченных овальбумина (ОВА)-специфических Т клеточного рецептора трансгенных CD8 + OT-I Т-клетки после культуре 3-х дней с дендритные клетки импульсный с различными количествами OVA. CD8 + Т-клеток, очищенный от селезенки и лимфатических узлов OT-я мышей были помечены CFSE и 1 х 10 5 клеток культивировали с 3,3 х 10 4 постоянного тока. Округ Колумбия, где с импульсным ОВА в течение 1 часа при температуре 37 ° C и промывают два раза до культуры. Через 3 дня, клетки, где собраны и помечены с анти-CD8-APC антител и Hoechst 33258, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии (50000 событий, собранных). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + клетки показано на рисунке. В качестве контроля, CD8 + T-клеток, культивированных один, показывает CFSE интенсивности, не разделили клетки, в то время как не-меченых клеток показывает, авто-флуоресценцию клеток и пределы обнаружить клеточных делений. Обратите внимание, что 4 пики CFSE можно увидеть в каждой из панелей в этом примере, показывая, что клетки претерпели до 3 подразделений. 3.2) В естественных условиях стимуляции На рисунке 2 показан CFSE профили CFSE меченных ОВА-специфических рецепторов Т-клеток CD8 + трансгенных OT-I Т-клеток, через 3 дня в естественных условиях ян присутствии 20 мкг ОВА. CD8 + Т-клеток, очищенный от селезенки и лимфатических узлов CD45.1 congenic OT-я мышей были помечены CFSE и 5 х 10 6 клеток вводили IV в боковую вену хвоста C56BL/6J (CD45.2 +) мышей. Через 2 часа мышей вводили IV с 20 мкг ОВА. Через 3 дня, селезенки от мышей были собраны, сделанные в суспензии отдельных клеток, меченных анти-B220-PerCP, анти-CD8-APC-Cy7 и анти-CD45.1-PE-Cy7 антител и Hoechst 33258, а затем проанализированы методом проточной цитометрии (1000000 событиям, собранным). Live (Hoechst 33258 -) B220-клеток показаны на левой панели и закрытого CD8 + CD45.1 + клеток показано на правой панели. В качестве контроля нестимулированных CFSE меченных CD8 + Т-клеток, показывает CFSE интенсивности, не разделили клетки, в то время как не-меченых клеток показывает, авто-флуоресценцию клеток и пределы обнаружить клеточных делений. Обратите внимание, что использование CD45 allotypic разница имеет жизненно важное значение в решении переданы CD8 + Т-клеток от хозяина, так как они незначительные подмножество общего CD8 + Т-клеток (слева). Обратите внимание, что большинство клеток падения в течение 7 CFSE пиков в этом примере (справа), указывая, что клетки претерпели до 6 дивизий. Рисунок 1. Способность CFSE меченных овальбумина (ОВА)-специфических Т клеточного рецептора трансгенных CD8 + OT-I Т-клеток реагировать в пробирке в постоянный импульсный с различными концентрациями ОВА, данные, приведенные время после 3 дней культуры. Обратите внимание, не разделили население CD8 + Т- клеток в отсутствие антигена (светло серый гистограмма) и авто-флуоресценции без меток населения (темно-серый гистограмма). Рис изображает CD8 + Т-клеток, которые разделили 1-3 раза на основе пиков CFSE разбавления, с большим количеством Т-клеток, деление на более высокие концентрации антигена. Рисунок 2. Способность CFSE меченных овальбумина (ОВА) конкретного Т-клеток рецептор трансгенных CD8 + OT-I Т-клетки, когда восприимчиво переданы в C57BL / 6 мышей в ответ на OVA, данные, приведенные 3 дня после приемных передачи Слева:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 Т-клеток у мышей получателя. Правая панель: профиль CFSE распространения. Обратите внимание, не разделили население CD8 + Т-клеток у мышей получатель не получает антиген (светло серый гистограмма) и авто-флуоресценции без меток лимфоцитов (темно-серый гистограмма). Рис изображает CD8 + Т-клеток, которые разделили 1-6 раз на основе пиков CFSE разбавления. Рисунок 3. Представительство различных молекулярных событий, которые происходят во время маркировки клеток с карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFDA, SE). Более подробную информацию о процессе см. Обсуждение текста. Примечание: 'CFSE "общий акроним, а не CFDA, SE, используется для описания маркировки реагента и маркировки процедуры в целом. Рис на основе приход 4.