Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas
Summary
Este documento describe los diferentes métodos de cultivo<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilms en cultivos de células epiteliales de las vías humanos. Estos protocolos pueden ser adaptados para estudiar diferentes aspectos de la formación de biopelículas, incluyendo la visualización del biofilm, la tinción de la biopelícula, la medición de unidades formadoras de colonias (UFC) de la película biológica, y el estudio de citotoxicidad biofilm.
Abstract
Biopelículas bacterianas se han asociado con un número de diferentes enfermedades humanas, pero el desarrollo del biofilm en general ha sido estudiado en la no-vida superficies. En este trabajo se describe la formación de biofilms protocolos de Pseudomonas aeruginosa en las células de las vías respiratorias epiteliales humanas (células CFBE) en un cultivo. En el primer método (llamado estática Co-cultura Modelo Biofilm), P. aeruginosa se incubaron con células CFBE cultivadas como monocapas confluentes en placas de cultivo tisular estándar. Aunque la bacteria es muy tóxica para las células epiteliales, la adición de arginina retrasos de la destrucción de la monocapa de tiempo suficiente para que las biopelículas que se forman en las células CFBE. El segundo método (llamado la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm), consiste en la adaptación de un aparato de biofilm celda de flujo, que se utiliza a menudo en biofilm de investigación, para dar cabida a un cubreobjetos apoyando una monocapa de células CFBE. Esta monocapa se inocula con P. aeruginosa y una bomba peristáltica entonces fluye a través de un nuevo medio de las células. En ambos sistemas, las biopelículas bacterianas se forman dentro de las 6-8 horas después de la inoculación. Visualización de la película biológica se ve reforzada por el uso de P. aeruginosa cepas que expresan constitutivamente la proteína fluorescente verde (GFP). La estática y el flujo de cultivo de células Co-ensayos de biofilm son sistemas modelo para principios de P. Aeruginosa infección de la fibrosis quística (FQ) de pulmón, y estas técnicas permiten a los diferentes aspectos de P. la formación de biofilm aeruginosa y virulencia a estudiar, incluyendo la citotoxicidad biofilm, la medición de biofilm UFC, y las manchas y la visualización de la biopelícula.
Protocol
Discussion
Los biofilms son comunidades de bacterias que se forman en respuesta a estímulos ambientales. Estas señales ambientales que llevan a cambios en la regulación mundial dentro de cada bacteria, lo que resulta en la unión a una superficie, la agregación, la producción de exopolisacáridos y otros fenotipos como el aumento de la resistencia antibiótica 10. Durante el último par de décadas, la evidencia más ha apoyado la hipótesis de que los biofilms juegan un papel importante en la patogénesis de las i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a G. O Toole de orientación y sugerencias en el desarrollo de estos modelos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Fibrosis Quística (ANDERS06F0 a GGA, STANTO07RO y STANTO08GA a BAS), los Institutos Nacionales de Salud (T32A107363 a GGA y R01-HL074175 a BAS), y el Centro Nacional para Recursos de Investigación Centros de Excelencia para la Investigación Biomédica (P20-COBRE RR018787 a BAS).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
