Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם
Summary
מאמר זה מתאר שיטות שונות של גידול<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilms על בתרבית תאים אפיתל דרכי הנשימה האנושית. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים לימוד היבטים שונים של היווצרות biofilm, כולל הדמיה של biofilm, מכתים של biofilm, מדידת המושבה להרכיב יחידות (CFU) של biofilm, ולומדים cytotoxicity biofilm.
Abstract
Biofilms חיידקי נקשרו עם מספר מחלות אנושיות שונות, אבל פיתוח biofilm יש בדרך כלל נחקרה על משטחים שאינם חיים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים biofilms להרכיב Pseudomonas aeruginosa על תאים אנושיים אפיתל דרכי הנשימה (תאים CFBE) גדל בתרבות. בשיטה הראשונה (כינה את המודל הסטטי שותף תרבות biofilm), עמ ' aeruginosa הוא מודגרות עם תאים CFBE גדל כמו monolayers ומחוברות על צלחות תרבות תקן רקמות. למרות החיידק הוא רעיל למדי לתאי האפיתל, תוספת של עיכובים ארגינין הרס monolayer מספיק זמן בשביל ליצור biofilms על תאים CFBE. השיטה השנייה (המכונה תא זרימה משותפת תרבות דגם biofilm), כולל התאמה של מנגנון הזרימה תא biofilm, המשמש לעתים קרובות biofilm מחקר, כדי להתאים coverslip זכוכית תמיכה monolayer ומחוברות של תאים CFBE. Monolayer זה מחוסן עם פ aeruginosa ומשאבה peristaltic אז זורם בינוני טרי על פני התאים. שתי המערכות, biofilms חיידקי טופס בתוך 6-8 שעות לאחר חיסון. ויזואליזציה של biofilm מוגברת על ידי שימוש P. זנים aeruginosa constitutively לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). סטטית תזרים Co-Cell תרבות מבחני biofilm הן מערכות מודל פ מוקדם aeruginosa זיהום של הריאות סיסטיק פיברוזיס (CF), ואת הטכניקות הללו מאפשרים היבטים שונים של פ biofilm aeruginosa היווצרות ארסיות להיחקר, כולל cytotoxicity biofilm, מדידת biofilm CFU, והכתים באופן חזותי biofilm.
Protocol
Discussion
Biofilms הן הקהילות של חיידקים היוצרים בתגובה לגירויים סביבתיים. אלה אותות סביבתיים להוביל שינויים רגולטוריים הגלובלית בתוך כל חיידק, וכתוצאה מכך מחייב משטח, צבירה, ייצור exopolysaccharides ו פנוטיפים אחרים כגון עמידות לאנטיביוטיקה גדל 10. במהלך השנתיים האחרונות של עשרות ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ג O Toole הדרכה והצעות בפיתוח המודלים האלה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס (ANDERS06F0 כדי GGA, STANTO07RO ו STANTO08GA כדי BAS), המכונים הלאומיים לבריאות (T32A107363 כדי GGA ו-R01 HL074175 כדי BAS), לבין המרכז הלאומי למחקר משאבים מרכזי מצוינות למחקר ביו (COBRE P20-RR018787 כדי BAS).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
