Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l'homme
Summary
Ce document décrit les différentes méthodes de plus en plus<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilms sur des cultures de cellules des voies respiratoires épithéliales humaines. Ces protocoles peuvent être adaptés pour étudier les différents aspects de la formation de biofilms, y compris la visualisation du biofilm, la coloration du biofilm, la mesure de la unités formant colonie (UFC) du biofilm, et étudier la cytotoxicité de biofilm.
Abstract
Biofilms bactériens ont été associés à un certain nombre de différentes maladies humaines, mais le développement du biofilm a généralement été étudié sur des surfaces non-vivantes. Dans cet article, nous décrivons les protocoles de formant des biofilms de Pseudomonas aeruginosa sur les cellules des voies respiratoires épithéliales humaines (cellules CFBE) en culture. Dans la première méthode (appelée le modèle de biofilm statique co-culture), P. aeruginosa est incubé avec des cellules cultivées comme CFBE monocouches confluentes sur le standard des plaques de culture tissulaire. Bien que la bactérie est très toxique pour les cellules épithéliales, l'ajout de retards arginine la destruction de la monocouche assez longtemps pour former des biofilms sur les cellules CFBE. La deuxième méthode (appelée la cellule de flux biofilm modèle de co-culture), implique l'adaptation d'un appareil cellulaire biofilm flux, ce qui est souvent utilisé dans un biofilm de recherche, pour accueillir une lamelle de verre supportant une monocouche confluente de cellules CFBE. Cette monocouche est inoculé avec P. aeruginosa et une pompe péristaltique s'écoule ensuite du milieu frais à travers les cellules. Dans les deux systèmes, les biofilms bactériens se forment dans les 6-8 heures après l'inoculation. Visualisation du biofilm est renforcée par l'utilisation de P. aeruginosa souches exprimant de manière constitutive la protéine fluorescente verte (GFP). Les analyses statique et dynamique cellulaire biofilm co-culture sont des systèmes modèles pour le début de P. l'infection aeruginosa de la fibrose (FC) pulmonaires kystique, et ces techniques permettent différents aspects de P. formation d'un biofilm aeruginosa et de la virulence d'être étudiée, y compris la cytotoxicité du biofilm, la mesure du biofilm UFC, et la coloration et la visualisation du biofilm.
Protocol
Discussion
Les biofilms sont des communautés de bactéries qui se forment en réponse aux stimuli environnementaux. Ces signaux environnementaux mondiaux conduire à des changements réglementaires au sein de chaque bactérie, résultant en se liant à une surface, l'agrégation, la production d'exopolysaccharides et d'autres phénotypes tels que la résistance aux antibiotiques a augmenté de 10. Au cours des deux dernières décennies, beaucoup de preuves a soutenu l'hypothèse que les biofilms jouent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier G. O Toole pour obtenir des conseils et des suggestions dans le développement de ces modèles. Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 au GGA, STANTO07RO et STANTO08GA au BAS), les National Institutes of Health (T32A107363 au GGA et R01-HL074175 au BAS), et le Centre national pour les Centres de Ressources de recherche d'excellence en recherche biomédicale (COBRE P20-RR018787 au BAS).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
