Isolement des cellules souches de l'homme xénogreffes de cancer du pancréas

1. Récolte de xénogreffes Souris Préparer la cellule tampon de dissociation: Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% sérum de veau foetal (FCS), la pénicilline-streptomycine, 200 U / ml de collagénase de type IV, et 0,6 U / ml dispase. Un athymiques (nu + / nu +) abritant un sous-cutanée de souris xénogreffe humaine du cancer du pancréas qui est inférieur à 1 cm de plus grand diamètre est euthanasié par asphyxie de dioxyde de carbone et de dislocation cervicale. La tumeur sous-cutanée est récoltée à partir du flanc de la souris par dissection à l'aide de pinces et de ciseaux et placé immédiatement dans le tampon dissociation cellulaire. Les tumeurs sont pesés et placés de nouveau dans 10 ml de tampon de dissociation cellulaire pour 1 gramme de tissu tumoral. 2. Générer une suspension monocellulaire de la xénogreffes Travailler dans une enceinte de sécurité biologique stérile, la tumeur est transféré à un 100 x 20 mm boîte de culture avec 1 ml de cellules tampon de dissociation. Les tumeurs sont mécaniquement hachée à l'aide de lames de rasoir stérile et une pince. La suspension de cellules tumorales est triturée à travers une pipette de 5 ml sérologiques 10 fois. Les pièces tumeur doit être assez petit pour ne pas obstruer la pipette de 5 ml sérologique. La suspension de cellules tumorales est transféré dans un tube conique de 50 ml contenant le volume restant de la cellule tampon de dissociation (rempli au moins 50%) et vortexés à vitesse maximale pendant 1 minute. La suspension de cellules tumorales est ensuite incubée à 37 ° C pendant 2 heures avec vortex intermittente pendant 1 minute toutes les 20 minutes. 3. Appauvrissent suspension cellulaire de débris tissulaires et des cellules mortes Après l'incubation de 2 heures la suspension cellulaire est vortexé à vitesse maximale pendant 1 minute. La suspension cellulaire est ensuite passée à travers un filtre de 70 um et recueilli dans un endroit frais 50 ml tube conique et ajusté à un volume final de 15 ml par tube. Afin de mieux séparer les cellules viables des cellules mortes et les débris tissulaires, la suspension de cellules tumorales est séparé par centrifugation de densité utilisant Ficoll-Paque Plus. Une sous-couche de Ficoll-Paque Plus est créé par pipetage 15 ml de Ficoll-Paque plus lentement en dessous de la suspension cellulaire en faisant attention de ne pas mélanger les deux couches. La suspension de cellules et les couches sont Ficoll est centrifugé à 500x g pendant 30 minutes avec les freins mis hors tension. Les cellules à l'interface de le Plus Ficoll-Paque et dissociation cellulaire tampon sont recueillies et transférées à une nouvelle de 50 ml tube conique. Frais DMEM supplémenté avec 10% de SVF est ajouté à la suspension de cellules pour le diluer 1:3 (par exemple 20 ml de milieu frais ajoutés à 10 ml de suspension cellulaire). Les cellules sont collectées par centrifugation à 450x g pendant 10 minutes, les médias décanté et le culot cellulaire est resuspendu dans 1 ml de tampon ALDEFLUOR. Dix microlitres de la suspension cellulaire est dilué avec 10 uL bleu trypan et les cellules viables sont comptées en utilisant un hématimètre. Si un grand nombre de cellules mortes ou des débris tissulaires sont notées au cours de cette étape, puis la séparation des cellules par centrifugation de densité peut être répétée (étapes 3.3 à 3.7). 4. Colorer des cellules pour le tri cellulaire activé par fluorescence Étiquette sept 12 x 75 mm tubes en polystyrène de test comme suit: Sans tache CD44-APC CD24-PE la souris CD31-biotine + souris de lignée biotine + souris H-2Kd-biotine ALDEFLUOR ALDEFLUOR + + IgG DEAB 2bκ-APC + IgG 2aκ-PE ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + souris CD31-biotine + souris de lignée biotine + souris H-2Kd-biotine. Diluer la suspension cellulaire dans 2 mL de tampon ALDEFLUOR à une concentration finale de 5-10 millions de cellules / ml et de garder sur la glace. Ajouter 100 ul de la suspension de cellules dans des tubes n ° 1, 2, 3 et 4 et les garder sur la glace. Ajouter une DEAB uL dans le tube n ° 6 et de garder sur la glace. Ajouter le réactif ALDEFLUOR à la suspension cellulaire diluée restantes 1000 – pli (par exemple, ajouter 1,6 uL ALDEFLUOR réactif à 1,6 ml de suspension cellulaire), bien mélanger, et placer sur la glace. Transférer 100 ul de ce mélange dans des tubes n ° 5 et 6, et le reste du mélange (1,4 ml) pour le tube n ° 7. Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 40 minutes. Mélanger la suspension de cellules toutes les 10 minutes afin d'empêcher les cellules de se fixer au fond des tubes. Centrifuger les cellules à 450x g et 4 ° C pendant 10 minutes et décanter ensuite le tampon. Resuspendre les boulettes dans des tubes # 1 et 5, 100 pi de tampon ALDEFLUOR. Pour les tubes n ° 2, 3, 4 et 6, ajouter 100 ul de tampon ALDEFLUOR contenant les anticorps appropriés dilué comme suit: 1h20 pour les IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, CD44-APC, et CD24-PEanticorps; 1:100 pour souris CD31-biotine, la souris de lignée biotine, et la souris H-2Kd-biotine. Dans le tube n ° 7 ajouter 1,4 mL de tampon ALDEFLUOR contenant une dilution 1:20 de CD44-APC, et CD24-PE anticorps et une dilution à 1:100 de souris CD31-biotine, la souris de lignée biotine, et la souris H-2Kd-biotine anticorps. Incuber les suspensions cellulaires sur la glace pendant 10 minutes. Centrifuger les cellules à 450x g et 4 ° C pendant 10 minutes et décanter ensuite le tampon. Resuspendre les boulettes dans des tubes n ° 1, 2, 3, 5 et 6 dans 100 ul de tampon ALDEFLUOR. Préparer 1,5 ml de tampon contenant ALDEFLUOR une dilution à 1:100 de streptavidine-PerCP protéines. Ajouter 100 uL dans le tube n ° 4 et ajouter 1,4 ml au tube n ° 7. Incuber les suspensions cellulaires sur la glace pendant 10 minutes. Centrifuger les cellules à 450x g et 4 ° C pendant 10 minutes et décanter ensuite le tampon. Resuspendre les boulettes dans des tubes n ° 1, 2, 3, 4, 5 et 6 dans 200 ul de tampon ALDEFLUOR. Reprendre le culot dans le tube n ° 7 à 2,8 ml de tampon contenant ALDEFLUOR 2 pg / ml d'iodure de propidium. Garder les tubes sur la glace en tout temps. Passez à travers les cellules de 35 um filtre à l'aide de 12 x 75 mm tubes en polystyrène de test avec des bouchons passoire. 5. Isoler les cellules souches du cancer par le tri cellulaire activé par fluorescence Un cytomètre en flux FACSAria est préparé pour le tri cellulaire. Contrôle de rémunération sont fixés en utilisant des cellules provenant de tubes n ° 1, 2, 3, 4 et 5. Gates sont créés en fonction de l'avant et latérales de dispersion des paramètres à collecter maillots cellule. Non-souris (PerCP-négatif) et viable (teinté d'iodure de propidium non), les cellules sont déclenchées en utilisant le canal FL-3. ALDH cellules + sont collectés basée sur des portails créés en utilisant DEAB cellules traitées (tube n ° 6) et le FL-1 canal. CD44 + CD24 + cellules sont collectées basée sur des portails créés en utilisant des cellules colorées par ALDEFLUOR, IgG 2bΚ-APC, et IgG 2aκ-PE (tube n ° 6) en utilisant le FL-4 et FL-2 canaux. Les cellules sont collectées dans 12 tubes x 75 mm à essai en polystyrène contenant 1 mL de DMEM supplémenté avec 10% de FCS. Après les cellules ont été triées, centrifuger la suspension cellulaire à 450x g pendant 10 minutes, décanter les médias, et remettre en suspension les cellules dans 500 ul DMEM frais complété avec 10% de FCS. Comptez le nombre de cellules triées à l'aide d'un hémocytomètre comme décrit dans l'étape 3.8. 6. Les résultats représentatifs Ce protocole permettra à l'isolement de l'ALDH + et CD44 + CD24 + pancréas CSC. Le pourcentage de cellules de souris dérivée est variable, mais nous avons constaté que la plupart des humains xénogreffes de cancer du pancréas contiennent 20-60% des cellules de souris dérivées en utilisant la souris CD31, cocktail lignée de souris et la souris H-2Kd biotine conjugué anticorps (figure 1A ). De même la fréquence de chaque population à partir du SCC xénogreffes différents est variable, mais généralement, nous avons constaté que 1-4% de la population cellulaire totale est ALDH + (figure 1B) et 0,2-5% CD44 + CD24 est + (figure 1C). Nous avons régulièrement compter manuellement les cellules triées à l'aide d'un hémocytomètre depuis le compte machine à FACSAria sont souvent inexactes en raison du non-cellulaire des particules détectées par le FACSAria. Figure 1. La cytométrie en flux parcelle représentant des populations spécifiques d'une xénogreffe cancer du pancréas. (A) Cellules coloration positive dans le FL-3 canaux (iodure de propidium +, CD31 + + souris lignée de souris, souris ou H-2Kd +) sont exclus de manière à isoler seulement viables et non des cellules dérivées de souris. (B) l'activité ALDH dans une xénogreffe de cancer pancréatique humain a été mesurée par cytométrie en flux utilisant le réactif ALDEFLUOR en présence et en absence de l'inhibiteur ALDH1 diéthylamino-benzaldéhyde (DEAB). Les cadres représentent portes qui dépeignent les cellules + ALDH qui ont été créés à partir de cellules traitées avec DEAB puis appliquée à des cellules non traitées. Les pourcentages de cellules + ALDH sont présentés dans la porte. (C) Le CD44 + CD24 + porte a été créé à base de cellules colorées au ALDEFLUOR, et les IgG 2bκ-APC (contrôle isotypique pour le CD44-APC) et des IgG 2aκ-PE (contrôle isotypique pour le CD24-PE) anticorps. Les pourcentages de cellules CD44 + CD24 + sont présentés dans la porte.