細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）

多タンパク質複合体の同定と解析のためのブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN – PAGE）：**このビデオプロトコルは、関連する出版物1に基づいています 。 Mahimaスワミー、ガブリエルM. Siegers、スサーナMinguet、ベルントWollscheid、とウォルフガングWA Schamel。科学のSTKE 2006（345）：PL2年7月25、2006、[DOI：10.1126/stke.3892006pl4]。 この文書を見るにはここをクリックしてください 。 1。透析細胞ライセートの調製 4℃で5分間350グラムで、遠心分離により収穫10 × 10 6個の細胞とペレット℃の氷冷PBS（レシピ1）、ステップ1.1のように遠心分離機1mLで細胞ペレット3回洗浄する。 再懸濁し、氷冷BN -溶解バッファー（レシピ2）の250μLのペレットとは、15分間氷上でインキュベートする。 4時15分° C不溶性物質を除去するため、13,000 gで遠心。 パスツールピペットの加熱された大径側を使用して、1.5 mlのマイクロチューブのキャップに穴を溶融し、4℃に冷却するためにチューブを氷上に置くキャップの穴とチルドチューブにステップ1.4から上清を移す。 近くにオープンしたチューブの上部に、キャップ上にピンセットで透析膜（10 kDの分子量カットオフ）を配置、および突出過剰透析膜を切り取ります。 パラフィルムで慎重に側にキャップをしっかり閉めます。 チューブを逆さにして4℃で10秒のための細胞培養の遠心機で50 – mLコニカルチューブに可能な限り最低の速度で逆さま遠心℃をチューブ右側を上げて避けるために、ピンセットを用いて遠心から反転チューブを取り外します。 コー​​ルドBN -透析バッファー（レシピ3）と撹拌プレートで100 mLのビーカーを用意します。 100μLのサンプルあたりBN -透析緩衝液の少なくとも10 mLを使用してください。 貼付逆さまのビーカー内のテープとチューブ、そして曲げたパスツールピペットを用いてキャップの下の穴から気泡を取り除く。 場所の磁石のスターラーの上にビーカー、スターラーのスイッチと寒い部屋で6時間または一晩放置する。攪拌は、透析膜に気泡を作成されていないことを保証するために時々確認してください。 新しい冷却したマイクロ遠心チューブ中で透析細胞ライセートを収集する。 2。 BN -ゲルを注ぐ注ぐ勾配ゲルは、勾配のミキサーを用いて室温で行われる。ポリアクリルアミドが非常に神経毒性であるので、手袋を着用する必要があります。 SDSとの接触を避ける。 攪拌プレート上に勾配のミキサーを配置し、フレキシブルチューブの部分に取り付けます。バルブを使用してチャネルを閉じ、クランプでチューブを閉じます。チューブに接続されて"ハイ"シリンダーの中にマグネチックスターラー15％を置きます。 peristaliticポンプにフレキシブルチューブを通し、その端にシリンジの針を取り付けます。その後、ゲル装置の2枚のガラス板との間に針を置く。 4％（レシピ5）及び15％（レシピ6）、ゲルソリューションを分離するAPSを追加し、使用直前にTEMEDを準備します。組み合わせたボリュームは、分離ゲルの体積に等しいはずです。 勾配のミキサー（"低"に4％、"高い"シリンダーに15％）の対応するシリンダー内にこれらのゲル溶液を注ぐ。 バルブを開いて、親指で左のシリンダーを介して押して、2つのゲルリザーバーを接続し、チャネル内の空気の泡を強制的に。 マグネチックスターラーのスイッチを、クランプを取り外し、1分あたり5 mlにperistaliticポンプに切り替える。ゲルがゆっくりとガラス板の間に流れるようになります。針が液体の上に常にであることを確認してください。 すべての液体がゲル装置を入力することができますし、イソプロパノールで軽く重ねます。ゲルは室温で少なくとも30分間重合することができます。 のdH 2 O（洗剤を使用しない）とすぐに注ぐ装置を清掃してください。 イソプロパノールを除去する、のdH 2 Oで洗浄し、ワットマン濾紙でのdH 2 Oを削除する。 、3.2％スタッキングゲル（レシピ7）準備APSを追加し、使用直前にTEMED。 分離ゲルの上にスタッキングゲルを注ぎ、泡を避け、ガラスプレートの間に櫛をご紹介。スタッキングゲルが重合した後、4℃でゲルをクールダウンすぐにサンプルをロードする前に、ゲルの平面への角度でそれを引き出して、ゆっくりとコームを抜き取る。これは、井戸の品質を向上させる急速にポケットを、入力する空気が可能です。 3。 BN – PAGEによる透析細胞溶解液の分離 4で乾燥した井戸で透析ライセート1〜40μLとマーカーミックス10〜20μlの（レシピ10）を読み込む℃に冷陰極バッファー（レシピ8）を各ウェルにサンプルを重ねます。 冷たい猫と内側のチャンバーを埋めるコー​​ルド陽極バッファ付きHODEバッファと下側/外側のチャンバー（レシピ9）。 サンプルが分離ゲルを入力するまで、ミニゲルまたは大ゲルに150Vに100 Vを適用します。 4でゲルを実行℃に 180 V（ミニゲル）または400 V（大ゲル）に電圧を増加し、色素フロントがゲルの端に達するまで実行する。ランは、大型ゲル用ミニ、および18〜24時間3〜4時間かかります。 4。二次元目SDS – PAGE 最初の次元BN – PAGEの車線、分子量マーカー用の定期的な車線、と持っている透析ライセートの分注し用の定期的な車線のための単一の大規模な車線で、標準の10％SDS -ゲル（レシピ12-15）の準備SDSサンプルバッファー（レシピ11）と混合し、95℃で5分間煮沸されて厚さSDSゲル上にBN – PAGEゲルスライスのローディングを簡素化するためにセロハンテープの二層で増加したスペーサーを使用してください。 電気泳動装置からプレートにBN – PAGEゲルを外し、ゆっくりと一つのプレートを取り出します。 スタッキングゲルを取り出して、目的のタンパク質を含むBN – PAGEゲルのレーンを切り取る。 室温で10分間、2 × SDSサンプルバッファーとインキュベートのBN – PAGEゲルスライスを置きます。 電子レンジでのBN – PAGEゲルスライスを短く（以上20秒）煮る。 室温でさらに15分間、ホットSDSサンプルバッファーでのBN – PAGEゲルスライスをインキュベートする。 SDS – PAGEゲル回避気泡、およびオーバーレイSDSサンプルバッファーとスライスのスタッキングゲルを優に超える大型のBN – PAGEゲルスライスをロードする。マーカーとライセートコントロールをロードする。 標準プロトコルにしたがって電気泳動を行います。 5。イムノブロッティングによってMPCのサブユニットの検出転送の場合は、SDS -ゲルの大きさに6ワットマンの論文やPVDF膜のフィッティングを準備。 30秒、100％メタノールにPVDF膜をインキュベートし、転送バッファ（レシピ16）にワットマンのペーパーを浸す。 場所再び3ワットマンの論文、PVDF膜、SDS -ゲル（ゲルをスタッキング削除）、および半乾きの転送細胞にサンドイッチのような構造三ワットマンの論文。 25分間20 Vを適用します。 標準免疫ブロットプロトコールにしたがってタンパク質を検出します。 6。代表的な結果我々は2次元BN / SDS – PAGE（図1A）でMPCの特性評価のための例のような真核19S、20S、および26Sプロテアソームの分析を提示する。 HEK293細胞は、膜を破壊し、膜タンパク質複合体を可溶化する界面活性剤として0.1％のTriton X – 100を含むバッファーで溶解した。これらの溶解物を、塩と小さな代謝物を削除するにはBN -透析緩衝液に対して透析した。その後、MPCはは、二次元目SDS – PAGEに続いて4〜15パーセントの勾配BN – PAGEにより分離した。タンパク質は20Sプロテアソームのサブユニットβ2とMcp21に対する抗体を用いたイムノブロッティングにより可視化した。 図1。細胞溶解物を使用して2次元BN-PAGE/SDS-PAGEのアプローチ。（）細胞溶解物から2D BN-PAGE/SDS-PAGEのアプローチのフロー図。 2D BN-PAGE/SDS-PAGEの（B）の模式スキーム。タンパク質とMPCは、最初の次元のBN – PAGEによる未変性条件下で分離されている。二次元の場合は、タンパク質および/またはMPCは、BN – PAGEによる分離後にゲルストリップをSDSで変性し、その後、SDS – PAGEに供した。単量体タンパク質は、最初の勾配ゲルと2番目の次元の線形ゲルによる双曲線角に移行します。 1つの具体的MPCのコンポーネントは、垂直線上にある、対角線の下に検索されます。 それは最初の次元BN -および二次元目SDS – PAGEの組み合わせによって、単量体タンパク質は二次元目（最初のと線形ゲルの濃度勾配ゲルによる双曲線角内に移行することが示されている（カマチョ-カルバハル、Wollscheid らら 2004）、 図 1B）。 MPCはのコンポーネントは、この対角線の下にあります。水平線の同じタンパク質のいくつかのスポットがいくつかの別個のMPC内のタンパク質の存在を示すのに対し、同じMPCのサブユニットを表すタンパク質は、2番目の次元の垂直方向に1行で見つけることができます。我々の実験ではβ2とMcp21に対するイムノブロット図2に示すようにこれらのプロテアソームサブユニットを含む特定のタンパク質複合体の存在が明らかになった。両タンパク質は、β2とMcp21はいくつかの異なるのMPCの構成要素を表すことを示す、水平線に配置された個々のスポットとして検出された。これらのMPCは、はっきりと調節サブユニットPA28と一緒に20Sプロテアソーム、（20Sプラス19Sキャップ）26Sプロテアソームと同定、および20Sはその大きさと組成に基づいて、単独でプロテアソームすることができます。一緒に、これらのresuLTSは、内因性のMPCは、細胞溶解物を用いて二次元BN-PAGE/SDS-PAGEのアプローチによって識別し、特徴付けることができることを示している。このメソッドは、サイズ、組成、とMPCの相対量を決定するために適用可能です。 図2。二次元BN-PAGE/SDS-PAGE後に免疫ブロット法による真核生物のプロテアソームの異なる形式の検出は。真核生物のプロテアソームの同定および解析には、HEK293細胞を0.1％トリトンX – 100で溶解した。携帯溶解物を透析し、その後別のMPCにBN – PAGE（4-15％）を行った。その後、二次元目SDS – PAGE（10％）は個々のサブコンポーネントのサイズ分離のために実行されました。イムノブロットは、20Sのコア複合体のMcp21とβ2サブユニットを認識する特異的抗体、および調節サブユニットPA28を行った。 特定の試薬のI.表（アルファベット順）： 試薬 会社 コメント 6 – アミノヘキサン酸 （ε-アミノカプロン酸） Sigma – Aldrich社、Taufkirchen、ドイツこの化学物質は刺激性であり、手袋で処理する必要があります。 アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液（40％）、ミックス32:1 Applichem、ダルムシュタット、ドイツこのソリューションは、神経毒であり、手袋で処理する必要があります。 ビス – トリスロス、カールスルーエ、ゲルマ- NY のBrij 96 Sigma – Aldrich社、Taufkirchen、ドイツクマシーブルーG250 Serva、ハイデルベルク、ドイツ – 多くのこのようなクマシーブルーR250またはコロイドCOO -マシーブルースとしてクマシー色素の他のタイプを代用しないでください。 ジギトニン Sigma – Aldrich社、Taufkirchen、ドイツジギトニンは有毒です。この決定 – ゲントを含むバッファーやサンプルを取り扱う際は手袋を着用してください。 Dodecylmaltoside Applichem、ダルムシュタット、ドイツトリトンX – 100 ロス、カールスルーエ、ゲルマ- NY トリトンX – 100は毒性があります。この洗剤を含む緩衝液または検体を取り扱う際は手袋を着用してください。 II。特定の材料および機器の表： 機器 会社 透析膜（10〜50 kDの分子量のオフカット） ロス、カールスルーエ、ドイツゲル電気泳動システム Bio – Rad社、ミュンヘン、ドイツから例えば勾配ミキサー自己作らまたはBio – Rad社、ミュンヘン、ドイツから市販されている蠕動ポンプアマシャムファルマシアバイオテク、フライブルク、ドイツポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜イモビロン- P、ミリポア、エシュボルン、ドイツセミドライトランスファー装置 Bio – Rad社、ミュンヘン、ドイツから例えばシリコンチューブ（3〜5 mm径、1mの長さ） NeoLab、ハイデルベルク、ドイツ III。レシピの表： いいえ バッファとソリューション コンテンツ コメント 1 リン酸緩衝食塩水（PBS） のNa 2 HPO 4 8.1 mMKH 2 PO 4 1.5mMの NaClを138 mMの KClを2.7 mMの適切に、事前に、比べ、解は、pH7.4にする必要があります。 2 BN -溶解バッファー ベースのバッファ ビス – トリス20mMの ε-アミノカプロン酸500mMの塩化ナトリウム20mMの EDTA、pH8.0の2mMのグリセリン10パーセント HClでpHを7.0に調整する。 4℃で保存します。 洗剤 1.0％ジギトニン0.5 またはのBrij 96 0.1〜0.5パーセントまたはトリトンX – 100 0.1〜0.5パーセントまたはDodecylmaltoside 0.1から0.5パーセント プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤 アプロチニン10μg/ mLのロイペプチン10μg/ mLの PMSF、1mMのフッ化ナトリウム0.5mMのオルトバナジウム酸ナトリウム0.5mMの適切な洗剤を経験的に決定する必要がありますし、他の溶解バッファーのレシピに使用されるものと同じである必要があります。 ジギトニンはちょうどのdH 2 O（-20〜5 mlのアリコート° Cで店舗）の2％のストック溶液から使用の前に追加する必要があります。 プロテアーゼ及びフォスファターゼ阻害し、ORSは、使用の直前に追加する必要があります。 ナトリウムorthova – nadateを添加すると、バッファは色で黄色になります。 3 BN -透析バッファ ベースのバッファ ビス – トリス20mMの ε-アミノカプロン酸500mMの塩化ナトリウム20mMの EDTA、pH8.0の2mMのグリセリン10パーセント HClでpHを7.0に調整する。 4℃で保存します。 洗剤 ジギトニン0.3から0.5パーセントまたはTriton X – 100を0.1パーセントまたはのBrij 96 0.1パーセントまたはDodecylmaltoside 0.1パーセント プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤 PMSF、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム0.5mMの適切な洗剤を経験的に決定する必要がありますし、他の溶解バッファーで使用されているものと同じである必要がありますが、指示された低濃度tionsで。 洗剤は、ゲル電気泳動のスタッキングステップでプリベントアグリゲーションに追加する必要があります。 プロテアーゼ及びフォスファターゼ阻害し、ORSは、使用の直前に追加する必要があります。 4 3X BN -ゲルバッファービス – トリス150mMの ε-アミノカプロン酸200mMの HClでpHを7.0に調整する。 4℃で保存します。 5 4％ゲルを分離 3X BN -ゲルバッファー（レシピ4）5.00 mLをアクリルアミド/ビスアクリルアミド1.50 mLののdH 2 O 8.50 mLの APS、のdH 2 O 54μLの10％ 5.4μLTEMED これらの試薬は重合を促進するとして、immedia – telyゲルを注ぐ前にAPSとTEMEDを追加。 このレシピは、30 mlゲルをキャストするのに十分です。注がれているゲルの数とサイズのボリュームを調整します。 6 15％がゲルの分離 3X BN -ゲルバッファー（レシピ4）5.00 mLをアクリルアミド/ビスアクリルアミド5.63 mLのグリセリン70パーセント4.38 mLの APS、のdH 2 O 42μLの10％ TEMED 4.2μL これらの試薬は重合を促進するとして、immedia – telyゲルを注ぐ前にAPSとTEMEDを追加。 このレシピは、30 mlゲルをキャストするのに十分です。注がれているゲルの数とサイズのボリュームを調整します。 アクリルアミド-ビスアクリルアミドの濃度は、10から18％に必要に応じて変えることができる。 7 3.2％ゲルをスタッキング 3X BN -ゲルバッファー（レシピ4）3.00 mLをアクリルアミド/ビスアクリルアミド0.72 mLののdH 2 O 5.28 mLの APS、のdH 2 O 120μLの10％ TEMED 12μlのこれらの試薬は重合を促進するとして、immedia – telyゲルを注ぐ前にAPSとTEMEDを追加。 このレシピは、30 mlゲルをキャストするのに十分です。注がれているゲルの数とサイズのボリュームを調整します。 8 陰極バッファービス – トリス15mMのトリシン50mMのクマシーブルーG250 0.02パーセント 10xのストックとして1リットルを準備し、4℃でHClでpHを7.0に調整し、店舗℃に使用前のdH 2 Oで1:10に希釈する。 このようなクマシーブルーR250またはコロイドクマのブルースのようなクマシー色素の他のタイプを代用しないでください。 9 陽極バッファービス – トリス50mMの 10xのストックとして1リットルを準備し、4℃でHClでpHを7.0に調整し、店舗℃に使用前のdH 2 Oで1:10に希釈する。 10 マーカーミックスアルドラーゼ（158 kD）の10 mg / mlのカタラーゼ（232 kD）の10 mg / mlのフェリチン（440および880 kDの）10 mg / mLのサイログロブリン（670 kD）の10 mg / mlの BSA（66および132 kDの）10 mg / mLのビス – トリス20mMの塩化ナトリウム20mMのグリセリン10パーセント HClでpHを7.0に調整する。 4℃で保存します。 分子量マーカーは、体外- genまたはファルマシアを含む複数のソースからも市販されている。 11 SDSサンプルバッファートリス12.5 mmを SDS 4パーセントグリセリン20パーセントブロモフェノールブルー0.02パーセント 6.8にpHを調整する。ジスルフィド結合を減らすために、9 mLのβ-メルカプトエタノールを加える。 粉体とβ- MER – captoethanolとしてSDSは毒性があります。そのため、手袋を使用し、ボンネットの下に働く。 12 4倍速より低いバッファトリス、1.5M SDS 0.4パーセント 8.8にpHを調整する。 粉末としてSDSは毒性があります。そのため、手袋を使用し、ボンネットの下に働く。 13 4倍の上部バッファートリス、0.5M SDS 0.4パーセント 6.8にpHを調整する。 粉末としてSDSは毒性があります。そのため、手袋を使用し、ボンネットの下に働く。 14 10％がゲルの分離アクリルアミド（30％）2.0 mLを 4倍速より低いバッファー1.5 mLののdH 2 O 2.454 mLの APS、のdH 2 O 40μLの10％ 6μLTEMED これらの試薬は重合を促進するとして、immedia – telyゲルを注ぐ前にAPSとTEMEDを追加。 このレシピは、30 mlゲルをキャストするのに十分です。注がれているゲルの数とサイズのボリュームを調整します。 15 4.8％ゲルをスタッキングアシルアミド（30％）320μL 4xの上部バッファー500μL のdH 2 O 1.16 mLの APS、のdH 2 Oで10％20μL TEMED 2μL これらの試薬は重合を促進するとして、immedia – telyゲルを注ぐ前にAPSとTEMEDを追加。 このレシピは、30 mlゲルをキャストするのに十分です。注がれているゲルの数とサイズのボリュームを調整します。 16 セミドライトランスファーバッファートリスさ48 mm グリシン39 mMのメタノール20パーセント 0.1％SDS のdH 2 Oで1リットルにボリュームを調整室温で保管してください。 粉やメタノールなどのSDSは毒性があります。そのため、手袋を使用し、ボンネットの下に働く。