زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي
Summary
في هذا الفيديو ، وصفنا توصيف المجمعات multiprotein (البلدان المتوسطية الشريكة) من الأزرق الأصلي بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (BN – PAGE). في البعد الأول ، يتم فصل lysates الخلوية مدال بواسطة PAGE – BN لتحديد البلدان المتوسطية الشريكة الفردية. في البعد الثاني SDS – PAGE ، وتنقسم البلدان المتوسطية الشريكة من الاهتمام لتحليل من قبل ناخبيهم immunoblotting.
Abstract
مجمعات Multiprotein (البلدان المتوسطية الشريكة) تلعب دورا حاسما في إشارة الخلية ، حيث يمكن العثور على معظم البروتينات في مجمعات وظيفية أو تنظيمية مع غيرها من البروتينات (سالي ، Glaeser وآخرون 2003). وهكذا ، ودراسة شبكات التفاعل البروتين البروتين يتطلب توصيف مفصل للبلدان المتوسطية الشريكة للحصول على فهم متكامل وظيفة البروتين والتنظيم. لتحديد وتحليل ، لا بد من فصل البلدان المتوسطية الشريكة في ظل الظروف المحلية. في هذا الفيديو ، وصفنا تحليل البلدان المتوسطية الشريكة التي كتبها زرقاء الأصلي بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (BN – PAGE). BN – PAGE هو الاسلوب الذي يسمح بالفصل بين البلدان المتوسطية الشريكة في التشكل الأصلية مع دقة أعلى من التي تقدمها الترشيح جل أو السكروز تنبيذ فائق الكثافة ، وبالتالي فهو مفيد لتحديد حجم MPC ، وتكوينها ، والوفرة النسبية (وSchägger فون Jagow 1991) ؛ (Schägger ، كريمر وآخرون 1994). بهذه الطريقة ، يتم فصل البروتينات وفقا لحجمها وشكلها الهيدروديناميكية في مصفوفة بولي أكريلاميد. هنا ، علينا أن نظهر للتحليل البلدان المتوسطية الشريكة من مجموع lysates الخلوية ، مشيرا إلى أن غسيل الكلى lysate هو خطوة حاسمة لجعل BN - PAGE تنطبق على هذه العينات البيولوجية. باستخدام مزيج من أول BN البعد والبعد الثاني SDS – PAGE ، وتبين لنا أنه يمكن البلدان المتوسطية الشريكة مفصولة PAGE – BN تقسيمها إلى مزيد من ناخبيهم الفردية SDS – PAGE. يتم تنفيذ التصور من مكونات السياسة النقدية عند انتهاء الجل بواسطة immunoblotting القياسية. كمثال للتحليل بواسطة PAGE MPC – BN ، اخترنا 19S جيدا اتسم حقيقية النواة ، 20S ، وproteasomes 26S.
Protocol
Discussion
في هذه الدراسة ، ونحن تصف تحليل البلدان المتوسطية الشريكة التي PAGE – BN. ويستخدم نهج 2D إلى البلدان المتوسطية الشريكة الأولى في ظل ظروف منفصلة الأصلي ، ومن ثم إلى مزيد من تقسيم منهم الى مكوناتها الفردية من جانب البعد الثاني SDS – PAGE.
مستعدون lysates عينات من الخلايا. لكثير من البلدان المتوسطية الشريكة من solubilization ، هناك حاجة إلى المنظفات المناسبة ، مما يحافظ على بنية مجمعات البروتين. هنا ، فإننا نستخدم تريتون 0.1 ٪ X – 100. ومع ذلك ، فإن المنظفات الأمثل وتركيزه مناسبة ويتم تحديدها تجريبيا لكل لجنة السياسة النقدية. في حالة تريتون X – 100 ، على سبيل المثال ، فقد أفيد أن تركيزات منخفضة المنظفات تسمح بتحديد نموذج مثنوي من 1 واو واو 0 – أتباز المعقدة (أرنولد ، فايفر وآخرون 1998). أعلى تريتون X – 100 تركيزات ، ومع ذلك ، تؤدي إلى تفكك للثنائيات ، وإلى زيادة مماثلة في موحودي F 1 0 – F أتباز المعقدة. وهذا ينسجم مع إحدى دراساتنا السابقة ، وتبين لنا أن يتم الاحتفاظ متعددي الكفاءات المعقدة مستقبلات خلايا T (TCR) عندما انتزعت مع تركيزات منخفضة من بريج 96 ، في حين أن استخدام تركيز أعلى أو المنظفات آخر يطلق عليه النتائج في ديجيتونين استخراج TCR موحودي (Schamel ، خيمينيز وآخرون 2005). يشيع استخدام المنظفات التي يمكن اختبارها وتشمل ديجيتونين (0.5 إلى 1 ٪) ، تريتون X – 100 (0.1 إلى 0.5 ٪) ، بريج 96 (0.1 إلى 0.5 ٪) ، أو dodecylmaltoside (0.1 إلى 0.5 ٪). هذه الكواشف والمنظفات nonionic ، والتي تميل الى ان تكون الأفضل لاستقرار السياسة النقدية. أن تدرك أنه ينبغي تجنب الاتصال مع الحزب الديمقراطي الصربي والمنظفات القوية الأخرى (كاماتشو – كارفاخال ، Wollscheid آخرون 2004).
مطلوب غسيل الكلى للجنة السياسة النقدية لتحقيق lysates فصل في هلام BN (كاماتشو – كارفاخال ، Wollscheid آخرون 2004) ؛ (Heiss ، Junkes وآخرون 2005). يبدو أن تعديل تركيز الملح أو إزالة الشوائب منخفضة الوزن الجزيئي أمر حاسم لدقة عالية. من الجدير بالذكر أيضا أن التحضيرات الغشاء والبلدان المتوسطية الشريكة ، والتي تم في وقت لاحق وimmunopurified eluted من الأضداد ، هي مناسبة لPAGE – BN (سوامي ، Siegers وآخرون 2006). في كلتا الحالتين ، فإن عينات لا يجب أن تكون لمدال BN – PAGE الانفصال ، وإذا نفذ تحلل الغشاء أو شطف في BN – تحلل العازلة.
لفصل البروتين PAGE – BN ، هناك حاجة لCoomassie الصبغة الزرقاء ، والتي تربط unspecifically للبروتينات ، ويغطي عليها مع الشحنات السالبة. وبالتالي ، Coomassie الزرقاء تمكن التنقل الكهربي للبروتينات نحو الكاثود عند pH محايدة (وSchägger فون Jagow 1991) ، (Schägger ، كريمر وآخرون 1994). علاوة على ذلك ، Coomassie الزرقاء يمنع التجميع البروتين في هلام التراص خلال الكهربائي. لPAGE – BN ، Coomassie G250 يجب أن يكون استخدامها بدلا من الزرقاء Coomassie R250 أو الغروية Coomassie البلوز.
قبل تشغيل BN – هلام ، فمن الضروري التأكد من أن النسبة المئوية للهلام يتلاءم مع الحجم المتوقع من لجنة السياسة النقدية في المصالح. BN – الجاهزة المواد الهلامية مع تدرجات مختلفة والمخازن المناسبة متوفرة تجاريا من Invitrogen (NativePAGE Novex النظام جل مكرر تريس). ولكن يمكن أيضا أن تكون المواد الهلامية BN – المعدة باستخدام خلاط التدرج مع مضخة persistaltic. لضمان وجود التدرج سليمة ، يجب أن تدفق السائل باستمرار خلال صب ويجب تجنب الفقاعات. نوصي تحميل التخفيفات عينة مختلفة على الجل بسبب الحمولة الزائدة يمكن ان يؤدي الى هطول الأمطار البروتين أثناء عملية الكهربائي. وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن تشغيل المواد الهلامية في BN – 4 درجات مئوية لمنع تدهور البروتين والبلدان المتوسطية الشريكة للحفاظ على حالها.
ويمكن أن يتحقق بعد BN – PAGE ، والتصور من البلدان المتوسطية الشريكة من خلال تلطيخ Coomassie الزرقاء الرائعة ، وتلطيخ الفضة أو immunoblotting. تصور العصابات البروتين تلطيخ Coomassie أو الفضة هي مناسبة لمزيد من التحليل عن طريق مطياف الكتلة (كاماتشو – كارفاخال ، Wollscheid وآخرون 2004). في حالة immunoblotting ، والظروف المثلى لنقل البلدان المتوسطية الشريكة من الفائدة يجب أن تكون مصممة تجريبيا. أن يدرك أيضا أن يتم نقل Coomassie زرقاء أثناء النشاف من هلام – BN. ولذلك ، سوف يكون عديم اللون الجل بعد نقل ناجحة ، في حين أن غشاء سيبذل اللون الأزرق. كذلك ، فإنه من المهم أن نذكر أن ليس كل الأجسام المضادة الأولية ، والتي تعمل للكشف عن بعد SDS – PAGE ، ينطبق على immunoblotting على PAGE – BN. يمكن أن يحدث أن الأجسام المضادة لا تعترف لجنة السياسة النقدية في المصالح لان مخفيا حاتمة بهم في التشكل الأصلية من البروتينات. للتغلب على هذه المشكلة ، فمن الممكن أن تفسد البروتينات داخل الجل – BN قبل نقل بالغلي الجل قريبا في المخزن 1X عينة SDS.
في مثالنا ، نحن لم تخضع للBN جل مباشرة إلى الكشف عن عصابات من البروتين. بدلا من ذلك ، ونحن كذلك تنقسم إلى BN – PAGE فصل lysate بواسطة dimensi secondعلى SDS – PAGE. في البعد الثاني جل SDS ، والبروتينات داخل موحودي ترحيل قطري القطعي بسبب الجل التدرج في الأول وهلام الخطية في البعد الثاني (كاماتشو – كارفاخال ، Wollscheid وآخرون 2004). هذا يسمح للبلدان المتوسطية الشريكة من السهل تحديد ، لأن مترجم انهم تحت هذا قطري القطعي. يتم فصل المكونات الفرعية للجنة السياسة النقدية المتميزة واحد في خط عمودي في البعد الثاني SDS – PAGE. يمكن التعرف على المكونات التي يتم المكونة من البلدان المتوسطية الشريكة dinstinct عدة على خط أفقي وفقا لحجم لجنة السياسة النقدية. ومع ذلك ، فإنه ينبغي النظر إلى أن العديد من البقع التي تظهر البروتين في سطر واحد عمودي يمكن أيضا أن تكون جزءا من مجمعات منفصلة التي تهاجر في نفس الموضع في PAGE – BN. يمكن الحصول على الدليل الأخير على أن وجودهم في لجنة السياسة النقدية من قبل نفس مقايسة الأضداد هلام تحول مقرا لها. في هذا الاختبار ، يتم تحضين الخلوية lysate مع جسم مضاد ضد بروتين ممثلة واحدة من النقاط التي تم تحديدها قبل PAGE – BN. هذه النتائج في التحول من جميع البلدان المتوسطية الشريكة التي تحتوي على هذا البروتين نحو كتلة الجزيئية أعلى في البعد الأول. والبروتينات الأخرى التي هي أيضا جزء من هذه البلدان المتوسطية الشريكة الخضوع لهذا التحول معقدة محددة ، وبالتالي من السهل تحديد في البعد الثاني SDS – هلام.
لا يمكن إلا أن يكون تحليل تركيبة البلدان المتوسطية الشريكة التي PAGE – BN ، بل أيضا في تحديد رياضيات الكيمياء من الممكن (وريث Schamel 2000) ؛ (Schamel 2001) ، (سوامي ، Minguet وآخرون 2007). لهذا الغرض ، يمكن إجراء فحص NAMOS (اللغة الأم المستندة إلى الضد التنقل التحول مقايسة). كما هو الحال في جل مقايسة الأضداد القائم على التحول ، ويتم تحضين lysates الخليوي مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة الوحيدات. هذا يؤدي إلى تحريض immunoshifts الكهربي في المواد الهلامية BN ، التي تسمح للاستدلال عن مدى التحول في البلدان المتوسطية الشريكة للرياضيات الكيمياء
في conlusion ، BN – PAGE مناسبة للتعرف على البلدان المتوسطية الشريكة ، وتحديد تكوينها ، والحجم ، فضلا عن وفرة نسبية. كما أجريت مقايسة NAMOS ، فإنه يوفر أيضا إمكانية لتحديد السياسة النقدية للرياضيات الكيمياء معينة. نظرا تطبيقه عام ، هذه التقنية هي أداة مفيدة جدا لتحديد خصائص البلدان المتوسطية الشريكة (ديكر ، مولر وآخرون 1996) ؛ (Wittig وSchagger 2008) ، (واغنر ، Rehling وآخرون 2009) ؛ (Wittig وSchägger 2009) .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نشكر مايكل ريث ، Schägger هيرمان ، ومارغريتا كاماتشو – كارفاخال للحصول على الدعم العلمي. وقد تم تمويل هذا العمل من FORSYS fuer Bildung Bundesministerium والإضافية اطلعوا (BMBF) ، عن طريق BIOSS من جمعية الألمانية للبحوث (DFG) ، ومعتمدة في جزء من مبادرة التميز للحكومات الاتحادية والدولة الألمانية (GSC – 4 ، Spemann كلية الدراسات العليا ).
References
- Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).
- Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
- Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).
- Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
- Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).
- Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
- Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).
- Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).
- Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).
- Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).
