分离出胰岛移植已被提出,是一个潜在的治疗1型糖尿病。在这里,我们描述的方法,从小鼠胰腺孤立的小岛和移植肾包膜下空间。
初以来的巴林杰和Reckard开创性的工作证明,胰岛细胞移植到糖尿病老鼠可以正常化,他们的血糖水平,胰岛移植已提议是一个潜在的治疗1型糖尿病1,2。最近,在人类胰岛移植的进步进一步加强了这种看法 1,3 。但是,两个主要的限制,防止胰岛移植被广泛的临床现实:(一)要求每名病人的胰岛细胞,这严重降低了潜在的接受者的数量大量,及(b)需要沉重的免疫抑制,从而显着影响小儿患者由于其脆弱性,长期免疫抑制人口。策略,可以克服这些限制有可能提高胰岛移植治疗效用。
小鼠肾囊下的胰岛移植是一种被广泛接受的模型,以探讨各种战略,以改善胰岛移植。这个实验需要高品质的小岛和隔离的胰岛细胞植入糖尿病收件人。这两个程序需要可以得到更好的视频演示手术步骤,不是由文字。在这里,我们通过视频和书面协议文件为这些程序的详细步骤。我们还简要地讨论一下不同的移植模型:,同源,同种,同源性自身免疫性,和异体自身免疫性。
在上面的章节中,我们描述了隔离和小鼠胰岛移植的详细步骤。在这里,我们简要地强调程序成功的关键步骤。
1。胰岛隔离
关键的步骤是确定一个最佳的酶消化时间(1.4),定位在十二指肠,胆总管(2.2.3)开放的止血钳,后37 cannulating胆总管(2.3),胰腺剧烈摇晃° C精华(3.2),并拆除外分泌细胞污染(3.3.7和3.3.16)。这些步骤的质量,产量和纯度的胰岛的一个戏剧性的影响。也许是最具技术挑战的第一步是胆总管插管。在许多小鼠,胆总管可很难想象,由于周围的筋膜。因此,它是常见的,试图cannulate胆总管的筋膜组织的渗透管的结果。在这些情况下,Liberase开始,以填补周围结缔组织和不灌注胰腺。如果发生此种情况,停止的Liberase流动和重新定位针,使其渗透进入胆管管腔。通过实践,它是可以快速识别针放置的最佳位置,以不破坏易碎管的情况下完成插管。
2。胰岛移植
关键步骤是STZ诱导的糖尿病(5.1)和胰岛的有效传递到包膜袋(5.3.14-5.3.16)。菌素是一种自然发生的葡萄糖类似物,是有选择性的胰岛素分泌细胞,胰岛9β-细胞毒性。然而,这种选择性的毒性发生在一个相对狭窄的浓度范围内。菌素高剂量可以导致高血糖的情况下迅速(2-3天)杀伤力的事实证明了这一点。因此,应采取应变和任何大规模实验开始前正在使用的小鼠的年龄,以确定最佳剂量链脲佐菌素。胰岛实物交割的包膜囊也是一个关键的一步。为了达成一致的结果,这是势在必行,以尽量减少损失胰岛期间及其运载工具。是否有缺陷或在肾囊囊的眼泪,或如果注入的体积过大,可能发生这种情况。温柔细心操作,避免使用光滑的玻璃探针准备包膜囊囊的损害,可以。此外,注射量可以减少小心去除上清液中的步骤5.3.6.3。如果上清液去除沉淀胰岛水平,通常有足够的空间,在包膜袋放在400至500胰岛多。但是,如果注射量太大,胰岛更容易泄漏出来的袋子,在移植过程中,影响实验的可重复性。
在这个协议中,它是可以修改的一些步骤,而且还能达到令人满意的成果。这些措施包括以下内容:(一),(b)为胰腺酶的不同方法,使用不同的酶消化胰腺(C)使用一个连续的聚蔗糖 – 钠泛影葡胺(FSD)梯度而不是单一密度Histopaque1077一步,和(D)胰岛移植肾subcapsule以外的地点。
据认为,胰岛移植可以克服的局限性的战略,将极大地提高其治疗的潜力。因此,这个协议的一个小鼠模型的详细使用,提供一个有吸引力的方法,确定这种战略。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由RO1 DK064938(TH)的支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI 1640 | Reagent | Gibco | 31800-022 | |
Liberase TL | Reagent | Roche | 05401020001 | |
Fetal Bovine Serum | Reagent | Gibco | 10437-028 | |
Histopaque1077 | Reagent | Sigma Aldrich | 10771 | |
Penicillin Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140 | |
Sodium Citrate | Reagent | Sigma Aldrich | S4641 | |
Streptozotocin | Reagent | Sigma Aldrich | S-0130 | |
HCl | Reagent | Fisher Scientific | A144-212 | |
Isoflurane | Reagent | Vedco | ISOSOL | |
Glass Capillary Tubes | Equipment | Fisher Scientific | 22362574 | |
Insulin Syringe | Equipment | BD Falcon | 329461 | |
27 Gauge Syringe Needle | Equipment | BD Falcon | 305109 | |
Hamilton Syringe #1702 | Equipment | Fisher Scientific | 14813133 | |
10cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 0875712 | |
6cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 07770212 | |
6-0 Suture | Equipment | Ethicon | 8726H | |
PE 50 Flexible Tubing | Equipment | Fisher Scientific | NC9083963 | |
5ml Disposable Syringe | Equipment | BD Falcon | 309603 | |
50ml Conical Tube | Equipment | BD Falcon | 352098 | |
15ml Conical Tube | Equipment | BD Falcon | 352097 | |
0.1mm Nylon Mesh | Equipment | Fisher Scientific | 22363549 | |
0.419mm Wire Mesh | Equipment | Newark Wire Cloth Company | 0300241 | |
Water Bath Incubator | Equipment | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
Dissecting Microscope | Equipment | Zeiss | Stemi SV6 | |
Inverted Microscope | Equipment | Nikon | TMS | |
Tissue Culture Incubator | Equipment | Napco | 6300 | |
Dissecting Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS14393 | |
McPherson-Vannas Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS500260 | |
Curved Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS15915 | |
Hemostatic Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS 500451 | |
Isoflurane Nebulizer | Equipment | Smiths Medical Surgivet | ISOTech 4 OHMEDA | |
Swing Bucket Centrifuge | Equipment | Dupont – Sorvall | RT6000D | |
Swing Bucket Rotor | Equipment | Dupont – Sorvall | H1000B | |
pH Meter | Equipment | Mettler Toledo/ Fisher Scientific | 09313509 | |
Gel Loading Tips | Equipment | Fisher Scientific | 05408151 | |
p200 Tips | Equipment | USA Scientific | 111-0730 |