Volumen fijo o fijado a presión: un modelo murino de shock hemorrágico

1. Instrumentos y la preparación del campo quirúrgico: 1. Instrumento de preparación. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizan utilizando técnicas asépticas. Una almohadilla quirúrgica azul y aderezo campo estéril se utilizan. Todos los materiales y los instrumentos son esterilizados antes de su uso. 6-0 de sutura, los aplicadores con punta de algodón, gasas, entre hombres llaves de paso de 3 vías, y los instrumentos son esterilizados en autoclave. Transductores, PE-50, y el tubo de PE-10 son el óxido de etileno esteriliza. Todas las llaves de paso de 3 vías, jeringas y agujas estériles que se reciban. 6-0 sutura se corta en trozos de 1 pulgada (6 piezas / animal) y poner en bolsas de esterilización pequeños. Punta de algodón, aplicadores, plazas 4×4 gasa, y entre hombres llaves de paso de 3 vías se colocan en bolsas de esterilización ya sea pequeña o mediana empresa y autoclave. Nuestros instrumentos quirúrgicos son esterilizados en autoclave cada noche. Ellos se lavan después de la cirugía utilizando un jabón antibacterial y agua del grifo. Ellos se dejan secar sobre un paño limpio pad azul quirúrgica. Luego se coloca cuidadosamente en una bolsa de esterilización y esterilizado para su uso al día siguiente. Como los transductores y los tubos tienen componentes de plástico, que deben ser esterilizados con gas, es decir, óxido de etileno. PE-10 tubería se corta en 5 trozos de una pulgada y se coloca en una bolsa pequeña de esterilización. PE-50 tubería se corta en 18 trozos de una pulgada y se coloca en una bolsa de esterilización medio. 2. Campo quirúrgico. Para configurar el campo quirúrgico, en primer lugar, a su vez en el esterilizador de cuentas en caliente para asegurarse de que llega a la temperatura adecuada 300-350 ° F antes de iniciar operaciones. A continuación, proceder con los pasos siguientes mediante la colocación quirúrgica pastillas de color azul hacia abajo en una mesa de trabajo se secó el alcohol. Un parche se bajo el microscopio y el otro va sobre el cojín eléctrico que circula en los analizadores de BP se encuentran. Coloque un campo estéril vendaje sobre ambas pastillas azules quirúrgica. Llenar una bandeja de acero inoxidable instrumento 1 / 3 de la forma con el 70% de alcohol. Use suficiente EtOH al 70% para cubrir todos los instrumentos quirúrgicos. Use un vestidor independiente campo estéril y colocarlo junto al microscopio. Coloque todos los instrumentos esterilizados, sutura, gasas, catéteres, y en este campo estéril. Tenga cuidado al abrir los instrumentos de sutura estéril y no para contaminar al tocarlos. Lo mejor es utilizar guantes estériles cuando se hace este procedimiento de instalación. 2. Puesta a punto mecánica y procedimientos: 1. Catéter de configuración. Para configurar el catéter de la pierna derecha murino utilizado para medir la PA, en primer lugar, ponerse los guantes estériles. A continuación, obtener la estéril tubos de PE-10 de la bolsa de autoclave. Coge la mitad de la tubería con el dedo índice y el pulgar dejando aproximadamente una pulgada entre ellos. Tramo de esta sección de la tubería sólo un poco para hacerlo más delgado de diámetro para ayudar en la inserción del catéter. Después de estirar el tubo se reduce a la mitad con unas tijeras estériles. La tubería de 5 pulgadas ahora debe ser de dos piezas de aproximadamente 2 ½ pulgadas de largo. Asegúrese de bisel al final se estiró. * NO ángulo de colocar en los bordes demasiado ya que esto podría aumentar las posibilidades de salir de la luz al picar a través de la parte inferior de la pared del vaso. Insertar una aguja 30G en el extremo romo sin estirar de la tubería. Obtener una jeringa estéril de 1 cc y una llave de 3 vías. Use una toallita con alcohol para esterilizar la parte superior del frasco 10cc estéril que contiene la solución salina heparinizada (0,1 ml de solución salina Heparin/9.9ml). Llene la jeringa con 0.6-0.7cc de la solución de heparina. Coloque la aguja 30G y el catéter hasta el final de la 3-forma en que está directamente enfrente de la final masculina. Llene la llave de paso, aguja 30G, y PE-10 tubos con la solución de heparina. Asegúrese de obtener todas las burbujas de aire del sistema. La manera más efectiva para eliminar todas las burbujas de aire es el uso de la gravedad. Punto de la aguja hacia el suelo y dejar que el tubo colgando de la mesa de trabajo. Dar a la base de la aguja un movimiento de los dedos y las burbujas flotan en la parte superior de la solución de heparina. Retire la aguja 30G de la 3-way y eliminar las burbujas. Extraer el líquido en la parte trasera de 3 vías con la jeringa de 1 cc para eliminar las burbujas que se encuentran atrapados en el 3-way y vuelva a conectar el tubo a la 3-way. Aproximadamente 1 cc de la mezcla debe permanecer en la jeringa. El ratón se reciben alrededor de 0.05cc de esta mezcla (como resultado del lavado del catéter para mantener la permeabilidad a la inserción) que equivale a aproximadamente 1 U de heparina / ratón. Colocar este catéter completado en el campo estéril vestirse con los instrumentos quirúrgicos. Para configurar el catéter de la pierna izquierda murino seguir el mismo procedimiento como se describe anteriormente, con la excepción de la llave de 3 vías. La pierna izquierda se utiliza para extraer la sangre y la llave de 3 vías no es necesario. Llene otra jeringa estéril con 1 cc de 0,15 0.2cc de la mezcla de solución salina heparinizada. Conecte la aguja 30G y tubi PE-10ng directamente a la jeringa de 1 cc. Rellene este sistema de la pierna izquierda del catéter con la solución. Eliminar las burbujas de este sistema, también. Colocar el catéter completado en el campo estéril vestirse con los instrumentos estériles. 2. Transductor de configuración. Conectar un transductor estéril para la digi-med BPA 400 analizador de acuerdo a las especificaciones del micro-med. Coloque una llave de 3 vías en ambos extremos del transductor. Llene una jeringa de 10cc con solución de Ringer lactato (RL) y adjuntarlo a la de 3 vías para que el transductor se recostará sobre la mesa de trabajo. Insertar una aguja 23G en ambos extremos de la pieza de precorte esterilizado de 18 pulgadas de tubería de PE-50. Conecte un extremo de la tubería de PE-50 para el 3-way con la jeringa de 10 cc adjunto. Llene el 3-way y PE-50 set-up con LR. Asegúrese de obtener todas las burbujas de aire del sistema como se describe en la sección anterior. Vuelva a colocar el 3-way por el transductor y llenar el transductor º y 2 de 3 vías con LR. Por último, coloque el metal macho-macho-leur bloqueo llave de paso de la aguja 23G de la tubería de PE-50 para la conexión a la sonda la pierna derecha murino. * Es muy importante que el líquido permanezca en el transductor cuando está en funcionamiento. * Seguimiento de calibración y cero de acuerdo con los procedimientos de Micro-med protocolo. 3. Procedimientos quirúrgicos y Experimental: 1. Procedimientos Quirúrgicos. Comience por la administración de una inyección intraperitoneal de sodio Pentobarbitol (Nembutol) (70mg/kg @ dilución 1:10). Este procedimiento se lleva a cabo, en primer lugar, recogiendo el ratón por encima de su jaula con la base (extremo más proximal) de la cola. Luego, coloque el animal en la parte superior de la jaula, mientras que mantiene su cola. Coge la nuca del cuello del ratón con el dedo pulgar y el dedo medio a ambos lados del ratón justo detrás de las patas delanteras. El dedo índice se utiliza para tirar de la piel en la región de la cabeza / cuello hacia la nuca para inmovilizar la cabeza. La cola del ratón se envuelve y se mantiene entre el dedo meñique y el anular, mientras que el dedo anular se presiona en la región lumbar de la columna vertebral del ratón. El ratón debe estar dormido en 5 minutos. Después de que el animal está anestesiado lugar que en la placa de metal quirúrgico en la posición supina. La técnica del lazo de la cinta suelta se utiliza para inmovilizar a los animales con cinta adhesiva a sus extremidades. La técnica de lazo flojo implica simplemente cortar tiras delgadas de cinta de embalaje y la cinta libremente alrededor de cada uno de los miembros anteriores a la pata inferior y alrededor de cada una de las patas traseras inferior a la pata. La cinta se pegaron a sí mismo y la izquierda sobre la cinta está conectado a la placa. Esto permite que las extremidades de los ratones a asumir una posición anatómica más natural. Zona abdominal e inguinal de los animales son después se afeitó con Oster A5 tamaño Clippers 40 de la hoja. Una gasa de 4×4 se moja con betadine y el área quirúrgica se limpió de la esterilidad. Después de la inmovilización y la esterilización, un cono de la nariz con 1 cc de isoflurano se coloca sobre la nariz del ratón durante unos segundos antes de hacer la incisión inicial. El cono de la nariz consiste en un tubo cónico de 50 cc llena con una gasa. La mitad de la parte inferior del tubo se corta la creación de un espacio para la nariz del ratón para descansar en el interior sin contacto. Una tapa (parte inferior de un contenedor de almacenamiento de tejidos) se coloca en la final de la 50 cc cónica para asegurar que los vapores de isoflurano no se escapen. Una vez que las respiraciones de los animales comienzan a disminuir, un pequeño de 4 a 5 mm incisión en la piel paralelamente a la izquierda músculo oblicuo interno del abdomen y el músculo transverso abdominal izquierda. La disección de la vena femoral y la arteria sigue. Asegúrese de no dañar los músculos que rodean los nervios o el tacto. Para comenzar esta disección, separar el tejido adiposo de los músculos abdominales oblicuos y transverso agarrando el tejido adiposo con la dumonts en la conexión abdominal. Tire de este tejido de la pared muscular. Entonces, contundente disección a lo largo de los músculos abdominales bromas fuera fascia y el tejido adiposo con el otro par de dumonts. Justo debajo de este tejido adiposo se encuentran la vena femoral y la arteria junto con el nervio femoral. * Asegúrese de no dañar el vasto intermedio, medial y lateral del músculo del cuádriceps femoral o el recto femoral. No hay realmente ninguna necesidad de agarrar o incluso tocar estos músculos. * No toque el nervio femoral Diseccionar el nervio por el acaparamiento del tejido adiposo que se encuentra al lado de él. Tire de este tejido lateral de la vena y la arteria y el nervio que seguir, ya que se integra en este tejido. A medida que el nervio se tira lateralmente, contundente disección de la fascia mediante la colocación de la dumonts otros, apuntan hacia abajo, en contra de la arteria y la apertura y cierre. Los vasos son muy superficiales, así que asegúrese de noprofundizar en los músculos subyacentes. Después de que el nervio se separa, el uso de la dumonts para separar la celebración de la fascia de los vasos de los músculos. Mantenga el dumonts cerrado y deslizar el dorsal dumonts a los vasos. Como la punta de la dumonts aparece en el otro lado de la vena, abierta a roma diseccionar la fascia. Mantener el dorsal dumonts a la embarcación y tomar la primera sutura. Coloque la sutura en el dumonts y tirar de la sutura de vuelta a través de la abertura que se hace entre los vasos y los músculos subyacentes. Una vez más, no hay necesidad de dañar los músculos circundantes. Ponga un total de 3, 6-0 suturas alrededor de la vena y la arteria. Sutura 1 es la más próxima a los músculos abdominales. Haga un nudo, sino que dejan sueltos y hemostático apagado. El borde cóncavo de la pinza debe descansar en la cavidad abdominal del animal. Sutura 2 es el más distal en el lugar. Esta sutura se puede atar de inmediato la ligadura de los vasos y hemostated, una vez más el lado cóncavo hacia abajo. Las suturas distal y proximal se utilizan para tirar los vasos tensa (para evitar la pérdida de sangre) y levantarlos un poco para ayudar en la inserción del catéter. 3 de sutura es una sutura de apoyo de los catéteres. Lugar esta sutura entre los puntos distales y proximales. Ate un nudo suelto que se utilizarán para asegurar el catéter dentro del vaso después de la inserción. Después de las suturas son seguras, identificar la arteria por la pared del vaso de espesor. Es muy blanco. Haga una pequeña incisión en la parte superior de la arteria usando el micro tijeras. Hacen de este agujero cerca de la sutura distal por lo que hay una amplia cantidad de arterias de la inserción del catéter inicial. Utilice el dumonts para abrir el agujero, colocando un extremo de la dumonts a la luz del vaso arterial y el cierre de las más de las paredes del vaso. Asegúrese de que la sutura media está próxima al orificio arterial por lo que se puede utilizar para mantener la sonda en su lugar después de la inserción inicial. Mientras mantiene la pared arterial empujar el catéter hacia la luz al tiempo que tira el vaso sobre el catéter. Ligeramente atar la sutura de apoyo medio para mantener la sonda en su lugar. Suelte la pinza hemostática proximal. Este comunicado se afloja la sutura proximal y volver a abrir la sutura alrededor de los vasos. En este punto, la presión arterial debe empujar la sangre en el catéter. La sangre palpitante debe ser visible en el catéter. Mantenga los recipientes alrededor del catéter con una Dumont y utilizar la otra para empujar el catéter en el vaso de 4 a 5 mm. Mantener el buque alrededor de la sonda ayuda a evitar la ruptura de la arteria. La punta del catéter debe situarse justo debajo de los músculos abdominales oblicuo interno y transverso. Para la prevención de coágulos de sangre en la línea arterial, extraer sangre en el catéter y presionar de nuevo en el ratón varias veces para infundir líquido heparinizada. Repita este procedimiento con la otra pierna para la canalización bilateral de la arteria femoral. Gancho del animal hasta el monitor de parámetros fisiológicos, es decir, el analizador de BPA-400 y el rubor de las líneas arterial. Ponga 1 o 2 gotas de solución salina estéril en la abertura quirúrgica para mantener la humedad de los tejidos circundantes. Asegúrese de mantener esta zona saturada durante todo el procedimiento. Coloque un campo estéril vendaje sobre el animal durante todo el procedimiento para ayudar a mantener la esterilidad. Coloque los instrumentos quirúrgicos en 70% de alcohol y limpie con una gasa estéril. Ponerlos en el esterilizador de calor cordón de 20 segundos para la esterilización entre los animales. Saque los instrumentos quirúrgicos y rociarlos con alcohol al 70% para ayudar a enfriar. Colocarlos en la gasa estéril. Asegúrese de que no hay alcohol a la izquierda en los instrumentos que goteará a volver a los animales al lado. 2. El shock hemorrágico. Más de un 15 minutos. período de tiempo, aproximadamente 1 / 2 del volumen sanguíneo de los ratones se retira lograr una presión arterial media de 28-32mm Hg. * Para un ratón 25-27G el volumen inicial de sangre extraída para lograr la presión deseada es de aproximadamente 0.6cc Este procedimiento es un método de presión fija en lugar de un volumen fijo. Estos procedimientos pueden, sin embargo se siguió tanto para sistemas fijos y hemorragia volumen fijo. Si bien es constantemente monitoreado, el animal permanecerá en estado de shock hemorrágico por 1,5-tres horas. A medida que el animal trata de compensar y la presión arterial media comienza a subir de nuevo ligeramente (visible a través del analizador de BP / AR) retirar la mayor cantidad de sangre para lograr la presión deseada. Aunque los suplementos (0.05cc Nembutol IP) son rara vez es necesario durante el procedimiento del SA, la respiración de los animales, el movimiento de los bigotes, las pruebas de reflejos, y la lectura digital BP / AR le ayudarán a determinar cuando un animal necesita un suplemento de la anestesia. Los animales se mantienen bajo la lámpara y en una almohadilla eléctrica que circula para ayudar a mantener una temperatura de 36-37 ° C a través del procedimiento de shock hemorrágico. La temperatura se controla a través de una sonda rectal. 3. Reanimación. Después del tiempo de descarga Elapses, el animal es resucitado (R) con ringer lactato (RL) en la solución de un volumen fijo de volumen 3 veces derramó la sangre de cada animal. El volumen de LR se administra a través de una bomba de jeringa conjunto de dispensar, a un ritmo constante, el volumen en un 15 minutos. intervalo. Retirar el catéter y ligar los vasos con los 3 puntos de sutura. Tire de la sonda justo después de la sutura proximal y corbata esta sutura por completo. Que eviten cualquier pérdida de sangre. El flujo colateral evita las extremidades posteriores se convierta isquémica. 4. Nota Rescitation. Después de las dos aberturas R extremidades posteriores son cosidos con suturas quirúrgicas 4-0 PDSII. La cinta de lazo flojo se retira y los animales son colocados en una jaula limpia que se mantiene en una almohadilla eléctrica que circula por la recuperación de varias horas después. Analgésico se debe administrar en los animales comienzan a despertar de la anestesia para gestionar adecuadamente el dolor. La buprenorfina (0.1mg/kg) se inyecta por vía subcutánea que los animales comienzan la actividad física, pero no antes, para no comprometer la función respiratoria. El uso de monitoreo agresivo después de la operación así lo justifican los IACUC protocolo aprobado, los comportamientos individuales de los animales, y sus condiciones médicas actuales, se recomienda. 4. Secretos para el éxito: Cuando la disección de los vasos, asegúrese de no tocar el nervio femoral Asegúrese de no dañar el recto femoral, recto lateral, y los músculos vasto interno. No hay realmente ninguna necesidad de agarrar o incluso tocar estos músculos. No cometa el ángulo del bisel del catéter demasiado fuerte ya que esto dará lugar a que el catéter sale de la luz y la hemorragia no controlada Asegúrese de tomar el esfuerzo adicional para seguir siendo tan estéril como sea posible. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en cualquiera de los sistemas de sonda o transductor. Asegúrese de tener líquido en LR transductor mientras está en funcionamiento. Una carrera en seco podría dañar el sistema de BP. Hacer el agujero pequeño arterial. Hacer el agujero arterial cerca de la sutura distal. Push catéter y al mismo tiempo tirando vasos encima de la inserción del catéter con el fin de evitar la extracción de la arteria. Asegúrese de mantener las aberturas quirúrgica en las piernas saturado con solución salina estéril para evitar daños en los tejidos sin control o la pérdida de líquidos. La paciencia y la delicadeza son fundamentales. Preste mucha atención a la fisiología del animal durante todo el experimento. 5. Nota preocupaciones operativo: Compruebe si hay isquemia en la pierna. Aunque el flujo colateral debe evitar esto. Animales podrían tener problemas con las patas traseras, como resultado de la manipulación quirúrgica y la inflamación asociados. Controlar el dolor adecuadamente. Tocar y, posteriormente, dañando el nervio puede llevar a la incapacidad de los animales a movilizar.