Volume fixe ou pression fixe: un modèle murin de choc hémorragique

1. Instrument de préparation du terrain et de chirurgie: 1. Préparation des instruments. Toutes les interventions chirurgicales sont effectuées en utilisant des techniques aseptiques. Un tapis bleu et vinaigrette chirurgicale champ stérile sont utilisées. Tous les matériaux et les instruments sont stérilisés avant leur utilisation. 6-0 suture, applicateurs coton-tige, de la gaze, mâle-mâle 3-way robinets, et les instruments sont stérilisés autoclave. Transducteurs, PE-50 et PE-10 tubes sont stérilisés oxyde d'éthylène. Tous les robinets à 3 voies, des seringues et des aiguilles stériles sont reçus. 6-0 suture est coupé en morceaux de 1 pouce (6 pièces / animal) et mis en sachets de stérilisation petits. Coton-tige applicateurs, des carrés de gaze 4×4, et mâle-mâle 3-way robinets sont mis en petite ou moyenne taille et la stérilisation des sachets en autoclave. Nos instruments chirurgicaux sont stérilisés autoclave chaque soir. Ils sont lavés après la chirurgie en utilisant un savon antibactérien et de l'eau du robinet. Ils sont mis à sécher sur un tapis bleu propre chirurgicale. Elles sont ensuite soigneusement placés dans une poche de stérilisation et stérilisés pour une utilisation le jour suivant. Depuis les transducteurs et les tubes ont des composants en plastique, ils doivent être stérilisés à l'aide de gaz, l'oxyde d'éthylène soit. PE-10 tube est coupé en morceaux de 5 pouces et placés dans un sachet de stérilisation petits. PE-50 tube est coupé en morceaux de 18 pouces et placés dans un sachet de stérilisation à moyen terme. 2. Champ opératoire. Pour configurer le champ opératoire, d'abord, mettez le stérilisateur à billes chaude pour s'assurer qu'elle atteigne la température appropriée, de 300 à 350 ° F avant de commencer la chirurgie. Ensuite, passez à l'étape suivante en plaçant chirurgicale tampons bleus vers le bas sur un alcool essuyé paillasse. Un pad passe sous le microscope et l'autre va sur le coussin chauffant circulant où les analyseurs BP sont situés. Placez un champ stérile pansement sur deux tampons chirurgicaux bleus. Remplissez un plateau en acier inoxydable instrument 1 / 3 de la voie avec 70% d'alcool. Utiliser suffisamment de EtOH à 70% afin de couvrir tous les instruments chirurgicaux. Utiliser un pansement stérile champ distinct et il place à côté de la loupe. Placez tous les instruments stériles, sutures, de la gaze, et les cathéters sur ce champ stérile. Soyez prudent lors de l'ouverture des instruments stériles et des sutures ne pas les contaminer en les touchant. Il est préférable d'utiliser des gants stériles lors de cette procédure d'installation. 2. Réglages mécaniques et procédures: 1. Mise en place du cathéter. Pour mettre en place le cathéter jambe droite murins utilisés pour mesurer BP, d'abord, mettre des gants stériles. Ensuite, récupérez l'stériles PE-10 tube de la poche autoclave. Prenez le milieu du tube avec le doigt pointeur et le pouce en laissant environ un pouce entre eux. Étirez cette section du tuyau juste un peu pour le rendre plus mince de diamètre pour aider à l'insertion du cathéter. Après l'étirement du tube le couper en deux à l'aide de ciseaux stériles. Le tube de 5 pouces devrait maintenant y avoir deux morceaux d'environ 2 ½ pouces de longueur. Assurez-vous de la fin de biseau étiré. * Ne PAS l'angle du bord biseauté trop car cela pourrait augmenter les chances de sortir de la lumière en perçant à travers la face inférieure de la paroi du vaisseau. Insérer une aiguille 30G dans l'extrémité émoussée non étirée de la tubulure. Obtenez une seringue stérile et une 1cc robinet à 3 voies. Utilisez un tampon imbibé d'alcool pour stériliser le bouchon du flacon stérile contenant 10cc la solution saline héparinée (0.1ml Heparin/9.9ml Saline). Remplir la seringue avec 0,6-0.7cc de la solution d'héparine. Fixez l'aiguille 30G et cathéter à la fin de la 3-way qui est directement en face de l'extrémité mâle. Remplissez le robinet, l'aiguille 30G, et PE-10 tube avec la solution d'héparine. Assurez-vous d'obtenir toutes les bulles d'air du système. Le moyen le plus efficace pour éliminer toutes les bulles d'air est d'utiliser la gravité. Pointez l'aiguille vers le sol tout en laissant pendre le tuyau à la paillasse. Donner l'embout de l'aiguille d'un coup de doigts et les bulles flottent à la surface de la solution d'héparine. Retirer l'aiguille 30G de la 3-way et enlever les bulles. Retirer du liquide dans le dos 3-way dans la seringue 1cc pour éliminer les bulles qui sont piégés dans le 3-way et remettez le tuyau à la 3-way. Environ 1cc du mélange doit rester dans la seringue. La souris recevra environ 0.05cc de ce mélange (comme un résultat de rinçage du cathéter pour maintenir la perméabilité à l'insertion) équivaut à environ 1U héparine / souris. Placez ce cathéter terminé sur le champ stérile vinaigrette avec les instruments chirurgicaux. Pour mettre en place le cathéter jambe gauche murin suivez la même procédure que décrit ci-dessus à l'exception du robinet à 3 voies. La jambe gauche est utilisé pour dessiner le sang et le robinet à 3 voies n'est pas nécessaire. Remplir une autre seringue stérile à 0,15 1cc-0.2cc du mélange hépariné saline. Hook up de l'aiguille 30G et PE-10 tubing directement à la seringue 1cc. Remplissez ce système jambe gauche cathéter avec la solution. Retirer les bulles de ce système, aussi. Placer le cathéter terminé sur le champ stérile vinaigrette avec les instruments stériles. 2. Transducteur Set-up. Branchez un capteur stérile pour le Digi-med BPA 400 analyseur selon les spécifications de micro-med. Attacher un robinet à 3 voies aux deux extrémités du transducteur. Remplir une seringue de 10cc avec une solution de Ringer lactate (LR) et l'attacher à la 3-way pour le transducteur à plat sur la paillasse. Insérer une aiguille 23G dans les deux extrémités de la pièce d'prédécoupés préstérilisés 18 pouces PE-50 tubes. Fixez une extrémité du tube PE-50 à la 3-voies avec la seringue 10cc ci-joint. Remplissez le 3-way et PE-50 mis en place avec LR. Assurez-vous d'obtenir toutes les bulles d'air du système comme décrit dans la section précédente. Remettez le 3-way à la sonde et de remplir le ième transducteur et 2 à 3 voies avec LR. Enfin, attacher le métal mâle-mâle Leur-verrouiller le robinet à l'aiguille 23G du tube PE-50 pour la fixation du cathéter jambe droite murin. * Il est essentiel que le fluide reste dans le transducteur lorsqu'il est en fonctionnement. * Suivre l'étalonnage et zéro selon les procédures de micro-med protocole. 3. Interventions chirurgicales et expérimentales: 1. Procédures chirurgicales. Commencez par administrer une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium (Nembutol) (70mg/kg @ dilution 1:10). Cette procédure est accomplie, d'abord, la cueillette de la souris vers le haut de sa cage à l'aide de la base (extrémité la plus proximale) de sa queue. Ensuite, placez l'animal sur le dessus de la cage, tout en tenant sa queue. Prenez la peau du cou de la souris avec le pouce et le majeur de chaque côté de la souris juste derrière les pattes avant. L'index est utilisé pour tirer la peau sur la région de la tête / cou en arrière vers la peau pour immobiliser la tête. La queue de la souris est alors enveloppé et maintenu entre l'auriculaire et l'annulaire tandis que le doigt d'anneau est enfoncé dans la région lombaire de la colonne vertébrale de la souris. La souris doit être endormi dans les 5 minutes. Après l'animal est anesthésié lieu les sur la plaque de métal chirurgicales dans la position couchée. La technique de boucle lâche de bande est utilisée pour immobiliser les animaux en enregistrant leurs extrémités. La technique consiste simplement à boucle lâche couper de fines bandes de ruban adhésif et la bande d'emballage vaguement autour de chacun des membres antérieurs inférieurs à la patte et autour de chacun des membres postérieurs inférieurs à la patte. Le ruban est ensuite collé à lui-même et la gauche sur le ruban est attaché à la planche. Cela permet aux extrémités de la souris à assumer une position anatomique plus naturel. Zones abdominales et inguinales de l'animal sont alors rasé à l'aide Oster A5 tondeuse taille 40 lame. Une gaze de 4×4 est aspergé avec de la Bétadine et de la zone chirurgicale est alors effacé de la stérilité. Après l'immobilisation et la stérilisation, un cône de nez avec 1cc de l'isoflurane est placé sur le nez de la souris pendant quelques secondes avant de faire l'incision initiale. Le cône de nez est constitué d'un tube conique 50cc rempli de gaze. La moitié de la partie inférieure du tube est découpé en créant un espace pour le nez de la souris pour se reposer à l'intérieur sans contact. Un capuchon (fond d'un conteneur de stockage des tissus) est placé sur l'extrémité conique de l'50cc pour assurer les vapeurs d'isoflurane ne s'échappe pas. Une fois une respiration de l'animal commence à ralentir, un petit 4-5mm incision est faite dans la peau parallèlement au muscle oblique gauche interne de l'abdomen et le muscle transverse gauche abdominus. La dissection de la veine fémorale et l'artère suit. Veillez à ne pas endommager les muscles ou les nerfs entourant le toucher. Pour commencer cette dissection, séparer les tissus adipeux des muscles abdominaux obliques et transverses en saisissant le tissu adipeux avec les Dumont à la connexion abdominale. Tirez ce tissu loin de la paroi musculaire. Puis, émoussé décortiquer le long de la musculature abdominale taquiner loin aponévrose et le tissu adipeux en utilisant l'autre paire de Dumont. Juste en dessous de cette tissu adipeux se situent dans la veine fémorale et l'artère avec le nerf fémoral. * Veillez à ne pas endommager le vastus intermedius, médial et latéral du muscle du quadriceps ou le droit antérieur. Il n'ya vraiment pas besoin de saisir ou même toucher ces muscles. * Ne touchez pas le nerf fémoral Disséquer le nerf de suite en le saisissant par le tissu adipeux qui se trouve à côté d'elle. Tirez ce tissu latéralement de la veine et l'artère et le nerf va suivre car il est intégré dans ce tissu. Comme le nerf est tiré latéralement, émoussée disséquer le fascia en plaçant les Dumont d'autres, le point bas, contre l'artère et leur ouverture et leur fermeture. Les vaisseaux sont très superficiels alors assurez-vous de ne pascreuser dans les muscles sous-jacents. Après le nerf est séparé, utilisez les Dumont de séparer le fascia tenant les vaisseaux vers les muscles. Gardez les Dumont fermés et glisser la dorsale Dumonts aux navires. Comme la pointe de l'Dumont apparaît de l'autre côté de la veine, ouvrez-les pour émousser disséquer le fascia. Gardez le dos Dumont à la cuve et de saisir la première suture. Mettez la suture dans les Dumont et tirez le fil de suture en arrière à travers l'ouverture pratiquée entre les vaisseaux et les muscles sous-jacents. Là encore, il n'est pas nécessaire d'endommager un muscle entourant. Mettez un total de 3, 6-0 sutures autour de la veine et l'artère. Suture 1 est la plus proximale des muscles abdominaux. Faire un noeud mais laisser le perdre et il hémostatique off. Le bord concave de la hémostatique doit reposer sur la cavité abdominale de l'animal. Suture 2 est la plus distale de l'emplacement. Cette suture peut être lié immédiatement ligature des vaisseaux et hemostated, encore une fois face concave vers le bas. Les sutures distale et proximale sont utilisés pour tirer les vaisseaux tendue (pour éviter la perte de sang) et les lever un peu pour aider à l'insertion du cathéter. Suture 3 est une suture de soutien cathéter. Placez cette suture entre les points de suture distale et proximale. Faire un noeud lâche qui sera utilisé pour sécuriser le cathéter à l'intérieur du navire après l'insertion. Après les sutures sont sécurisés, d'identifier l'artère par la paroi de la cuve d'épaisseur. Il est très blanc. Faire une petite incision sur le dessus de l'artère à l'aide de la microciseaux. Faire ce trou près de la suture distale donc il ya une quantité suffisante de l'artère pour l'insertion du cathéter initiale. Utilisez les Dumont d'ouvrir le trou en plaçant une extrémité de l'Dumont dans la lumière du vaisseau artériel et les fermer au cours de la paroi du vaisseau. Soyez sûr de la suture proximale du milieu est au trou artérielle et peut donc être utilisé pour maintenir le cathéter en place après l'insertion initiale. Tout en maintenant la paroi artérielle pousser le cathéter dans la lumière tout en tirant le bateau sur le cathéter. Légèrement arrimage de la suture de soutien du milieu pour maintenir le cathéter en place. Communiqué de la pince hémostatique proximale. Cette version va desserrer la suture proximale et rouvrir la suture autour des vaisseaux. À ce stade, la pression artérielle devrait pousser du sang dans le cathéter. Du sang pulsé doit être visible dans le cathéter. Tenir les vaisseaux autour du cathéter avec un Dumont et utiliser l'autre pour pousser le cathéter dans le vaisseau d'environ 4-5mm. Tenir le récipient autour du cathéter permet d'éviter la déchirure de l'artère. L'extrémité du cathéter doit reposer juste sous les muscles internes abdominus obliques et transverses. Pour la prévention de caillots sanguins dans la ligne artérielle, prélever du sang dans le cathéter et le repousser dans la souris à plusieurs reprises pour infuser fluides hépariné. Répétez cette procédure pour l'autre jambe pour la canulation bilatérale de l'artère fémorale. Crochet de l'animal à l'écran des paramètres physiologiques, c'est à dire l'analyseur BPA-400 et rincer les lignes artérielles. Mettez 1 ou 2 gouttes de solution saline stérile dans l'ouverture chirurgicale pour préserver l'humidité des tissus environnants. Soyez sûr de garder cette zone saturée pendant toute la procédure. Placez un champ stérile pansement sur l'animal pendant toute la procédure pour aider à maintenir la stérilité. Placer les instruments chirurgicaux en alcool de 70% et les essuyer avec une gaze stérile. Mettez-les dans le stérilisateur à chaud de perles pour ~ 20 secondes pour la stérilisation de l'animal. Retirer les instruments chirurgicaux et les pulvériser avec de l'alcool à 70% pour les aider à se rafraîchir. Placez-les sur le tampon stérile. Assurez-vous qu'il n'ya pas d'alcool à gauche sur les instruments qui s'égoutte dans les animaux suivant. 2. Choc hémorragique. Plus d'un 15min. période, environ 1 / 2 du volume sanguin de la souris est retirée atteindre une pression artérielle moyenne de 28-32mm Hg. * Pour une souris de 25 27g le volume initial de sang prélevé pour atteindre la pression souhaitée est d'environ 0.6cc Cette procédure est une méthode de pression fixe, par opposition à un volume fixe. Ces procédures peuvent cependant être suivie à la fois pour la pression fixe et une hémorragie volume fixe. Tout en étant constamment surveillé, l'animal restera en état de choc hémorragique de 1,5-trois heures. Comme l'animal tente de compenser et de la pression artérielle moyenne commence à augmenter à nouveau légèrement (visible via l'analyseur BP / HR) de retirer plus de sang pour atteindre la pression désirée. Bien que les suppléments (0.05cc IP Nembutol) sont rarement nécessaires pendant la procédure de SH, la respiration des animaux, mouvements moustaches, des tests de réflexe, et le numérique BP / RH lecture permettra de déterminer quand un animal a besoin d'un complément de l'anesthésie. Les animaux sont gardés sous la lampe et sur un coussin chauffant circulant pour aider à maintenir une température de 36-37 ° C grâce à la procédure de choc hémorragique. La température est contrôlée par l'intermédiaire d'une sonde rectale. 3. Réanimation. Après le temps de choc Elapses, l'animal est ressuscité (R) en utilisant Ringer (LR) solution à un volume fixe de 3x le volume de chaque animal sang versé. Le volume LR est administré via une pompe seringue mis à dispenser, à un taux constant, le volume sur une 15min. intervalle. Retirer le cathéter et ligaturer les vaisseaux en utilisant les 3 points de suture. Tirez le cathéter, juste après la suture proximale et une cravate cette suture complètement éteint. Cela permettra d'éviter toute perte de sang. Circulation collatérale empêche les membres postérieurs de devenir ischémique. 4. Message Rescitation. Après deux ouvertures R membres postérieurs sont cousues à l'aide de suture stérile, 4-0 PDSII. La bande boucle lâche est enlevé et les animaux sont placés dans une cage propre, qui est gardé sur un coussin chauffant circulant pour la récupération après plusieurs heures. Antalgique doit être administré comme les animaux commencent à se réveiller de l'anesthésie pour bien gérer la douleur. La buprénorphine (0.1mg/kg) est injecté par voie sous cutanée comme les animaux commencent une activité physique, mais pas avant, afin de ne pas compromettre la fonction respiratoire. L'utilisation de la surveillance post-opératoire agressifs tel que justifié par IACUC protocole approuvé, les comportements des animaux individuels, et les conditions actuelles médical est recommandé. 4. Secrets de la réussite: Lors de la dissection des vaisseaux, veillez à ne pas toucher le nerf fémoral Soyez sûr de ne pas endommager le muscle droit antérieur, le rectus lateralis et vastus medialis muscles. Il n'ya vraiment pas besoin de saisir ou même toucher ces muscles. Ne faites pas l'angle du biseau de la sonde trop forte car cela conduira à la sortie de la lumière du cathéter et de saignement incontrôlé Assurez-vous de prendre l'effort supplémentaire de rester aussi stérile que possible. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air dans l'un des systèmes de cathéter ou un transducteur. Assurez-vous d'avoir du liquide dans le capteur LR alors qu'il est en fonctionnement. Un fonctionnement à sec peut endommager votre système BP. Faire le trou artérielle petits. Faire le trou artérielle à proximité de la suture distale. Poussez cathéter tout en tirant sur elle pour la cuve d'insertion du cathéter afin d'éviter de déchirer l'artère. Soyez sûr de garder les ouvertures chirurgicales dans les jambes saturé avec une solution saline stérile pour éviter tout dommage ou perte incontrôlée des tissus fluides. Patience et finesse sont critiques. Portez une attention particulière à la physiologie de l'animal tout au long de l'expérience. 5. Préoccupations après Opératif: Vérifier l'ischémie dans la jambe. Bien que le débit collatéral devrait empêcher cela. Animaux pourrait avoir de la difficulté à l'aide des membres postérieurs à la suite d'une manipulation chirurgicale et l'inflammation associées. Gérer la douleur de façon appropriée. Toucher et ultérieurement d'endommager le nerf pourrait conduire à l'incapacité de l'animal à se mobiliser.