Bölüm 1. Cerrahi Alan hazırlayın Biyolojik tehlikeli reaktifler (örneğin retroviral vektörler) ile çalışıyorsanız, ameliyat, bir Biyogüvenlik II kabini (BSC) içinde yapılmalıdır. BSC içinde transdüser ultrason geri yansıma mikroskobu (UBM), BSC yanında oturur, ve özel olarak tasarlanmış bir cerrahi sahnede bir motor kontrollü desteği ile yerinde tutulur. On line video gösterildiği sahne oluşturmak için gerekli bileşenleri listelenmiştir. Bu liste, çeşitli açılarda (istek üzerine) sahne görüntüleri ile birlikte, inşaat izin vermelidir. Laparotomi açılış ve kapanış (karın boşluğu, iç organlar erişime izin vermek için açık kesilir cerrahi işlem), genellikle plastik desteğiyle bir emici ped üzerine yapılır. Ameliyat öncesinde tüm gerekli araçları (örneğin, jilet, cerrahi makas, forseps, yüklü AutoCLIP uygulayıcısı, vb) ve malzeme (örneğin PBS, dikiş, anestezi, fare tutucu ve örten plaka, vb.) Sterilize edilmiş ve yerleştirilmiş olmalıdır cerrahi alan. Kesi açıktır süreyi sınırlandırılması cerrahi ile başarı şansı maksimize etmek için önemlidir. Bütün hayvan işleme çözüm MB-10 veya eşdeğeri ile dezenfekte edilmiş eldiven ile yapılmalıdır. Tekrarlanan dezenfeksiyonu, steril eldiven sağlamak için gerektiği gibi yapılmalıdır. Bölüm 2. Fare Anestezi 1 cc şırınga, 1 kısım Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) PBS içinde 25 mg / ml magnezyum sülfat sterilize süzülmüş 4 parça içeren anestezik solüsyonu ile doldurun. 10 mg / mg / ml magnezyum sülfat pentobarbital ve 20 ml'lik bir çözüm neden olacaktır. Her fare bireysel ağırlıklı, ve vücut ağırlığı pentobarbital kg 90 mg ile enjekte edilmelidir (örneğin, 28 gram fare, 250 mcL ile enjekte edilir). Cilt ve karın kas hem penetran karın hamile bir fare embriyonik gün (E) 9.5 (intraperitoneal, ip) (gerektiği gibi diğer yaşları kullanabilirsiniz) içine enjekte edilir. Fare için 8-12 dakika sigara duyarlı olmaya izin ver. Yeterli anestezi hayvanın rahat bir duruş tarafından onaylandıktan sonra, kuyruk ve ayak tutam yanıt olarak hareket azlığı olmalıdır. Hafifçe parmak tırnakları arasındaki kısma çok hassastır ve herhangi bir yanıt gibi pinching eksikliği, hayvanların yeterli anestezi olduğunu gösterir. Kuyruk ve ayak tutam tamamen tepkisiz olan hayvanlar, hatta bazı zamanlar ilk cerrahi kesi yanıt biraz seğirme unutmayın. Ancak, bu refleksif bir tepki ve yetersiz anestezi anlamına gelmez. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için petrol bazlı oftalmik melisa fare gözler için uygulanmalıdır. Fare anestezi olmak için beklerken set-up cerrahi alan ve ultrason makinesi. Retrovirüs veya lentivirüs kullanımını gerektirir BSL2 çevreleme, viral enjeksiyonları yukarıda belirtildiği gibi bir Biyogüvenlik II Kabinesi yapılmalıdır. Buna ek olarak, virüs ile temas gelen tüm çözümler ve tek kullanımlık malzemeler,% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile dekontamine edilmelidir. MB-10 (sterilizasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir cerrahi aletler ve ultrason cihazları http://www.quiplabs.com/mb10.htm ), ya da söz konusu tesisi tarafından kullanılan bir eşdeğer. Bölüm 3. Embriyolar, Pozlama Mümkünse verilen hayvan tesis ve kullanılabilir alan kısıtlamaları bağlı cerrahi alan ayrı bir yerde cerrahi hazırlık alanı olduğu için tercih edilir. Bu hayvanlar arasında çapraz kontaminasyon olasılığını en aza indirecektir. Ameliyat başlatmak için, hayvanın sırtına steril emici bir yüzeye yerleştirin ve karın bölgesinde% 70 etanol ile iyice yıkayın. Daha kapsamlı cerrahi öncesi tedaviler (örneğin, ardışık Betadine mermi ve% 70 etanol yıkar) istihdam, ancak deneyimlerimiz bu kemirgen sağkalım cerrahi bu tür için gerekli değildir olabilir. Bir çift kenar jilet kullanarak, karın yaklaşık 1 inç genişliğinde ve 1,5 santim uzunluğunda bir alanda saç tıraş. Yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, ustura ile kısa hızlı hareketleri kullanın. Cerrahi alanında uygun şekilde tedavi edilmesi önemlidir, ama aşırı ıslatma tabi değil, bu hayvanın gereksiz tüyler ürpertici neden olabilir ve hatta hipotermi. Ince cerrahi makas kullanarak hayvan (ikinci bir kesi ile yardımcı olacaktır bağ dokusu ile kesme, kas cilt tutan) karın kas yoluyla ilk olarak deri yoluyla 1 "longitudinal kesi yapmak. Not prosedürü bakım boyunca cerrahi aletler steril kalır ve gerektiği gibi araç ipuçları non-ste ile temas gelirsen dezenfektan ile tedavi (yani yapılan olmalıdır sağlamak için alınacak) malzeme rile. Kullanarak forseps rahim boynuzları dikkatle çizmek ve her iki tarafta embriyo sayısı kaydetmek. Hayvan geri uterin boynuz en fazla iki komşu maruz kalan embriyoların (iki her iki tarafta yapılandırma bağlıdır hangi seçim), yerini terk ederken. Annesi onu geri kalırken, bu bağlamda, iki embriyo belli bir süre maruz ve PBS içinde yıkanıyor. (Figure1A) ameliyat sırasında nerede olacak pleksiglas sahibinin sırtında hayvan koyun *. Sonra, bir çift yeşil silastik membran (L RTV silikon kauçuk tabanı kullanılarak yapılan ve üzerinden biraz yerleştirilir forseps, anne üzerinde aşağı düşük (kullanmak için önce MB-10 ile dezenfekte edilmelidir) 10cm doku kültürü çanak ** kür ajanı; Dow Corning ürün numaraları sırasıyla 3142761 ve 2156946). Hayvan üzerinde plaka aşağıya düşürmek gibi, rahim dokusu enjekte edilecek iki embriyo arasında kavrama forseps kullanımı, ve nazikçe onları zarından çekin. Aynı zamanda, plaka sahibinin üzerine tamamen aşağı indirdi ve raptiyeler bir yerde tutmak için itilir. Önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS embriyolar daha sonra tamamen kapsayacak şekilde çanak eklenir. Maruz kalan embriyoların rahim duvarına (Figure1B) üzerinden gerçek zamanlı görüntü oluşturmak için ultrason probu (Figure1A) altındaki hayvan ve maruz kalan embriyoları içeren enjeksiyon aşamasında yerleştirin. Prob daha sonra PBS banyoya (motorlu kontrollerini kullanarak) doğrudan yansıması embriyolar üzerinde düşürülür. Probu yaklaşık 2-3 mm uzaklıkta embriyolardan görüntüler elde edilebilir. Bu görüntüleri toplamak için ileri ve geri dolaşacaktır sondadan embriyoların isabet etmediğini emin olmak için çok önemlidir. * Annesi ameliyat sırasında aittir tutucu bir makine atölyesi tarafından kolayca yapılabilir. Bu, üst üste yapıştırılmış iki pleksiglas iki tarafla da geniş bir pleksiglas tabanı, ve aralarında bir boşluk (fare için yeterince geniş sırtında yatarken sığdırmak için) içermelidir. Taraflar, daha sonra siyah balmumu (diseksiyon tepsiden) ile dolu bir vadi zemini, olmalıdır. O balmumu raptiyeler embriyoların enjeksiyon sırasında yıkanmış olduğunu PBS plaka basılı basıldığında içine malzeme olarak hizmet vermektedir. : ** 10cm bakteriyel yemekler alt merkezi (Heavy Duty Taşınabilir Punch ve inci 13/16 inç dairesel kalıp ile yapılabilir delikli bir delik (çapı yaklaşık 2 cm) olmalıdır http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). Buna ek olarak, orta deliğin (uzakta yaklaşık 1.5cm) her iki tarafında iki küçük delik bir alev ısıtılmış iğne (ya da tabii bir matkap ile yapılmış olabilir) ile yanmış olmalıdır. Bu delikler daha sonra vakum yağ ile kaplıdır ve plaka sahibinin üzerine tutun raptiyeler aracılığıyla siyah mum içine itmek olacaktır. Vakum gres PBS dışarı sızmasını önlemek için. Bölüm 4. Mikroenjeksiyon İğne içine Virüs Yükleme Bir 1mm (iç çapı) pah Moda mikroenjeksiyon iğne, cam kapiller çekti. Iğne keskinliğini kritik ve yeterince keskin bir iğne ile çalışan amnionic kesesi, rahim duvarı ve penetrasyonu ciddi tehlikeye sokabilir ve deneysel yetmezliğine yol açabilir. Bilenmiş iğne daha sonra boru üzerinden manuel bir infüzyon / çekme pompası (diğer cihazlar iğne yükleme ve boşaltma düzenlemek için kullanılan, ancak bu ne monte edilmiş 25 mcL mikroenjektör bağlı pipet tutucu, içine yerleştirilir video gösterilir). Mikroenjektör, tüp ve iğne en iyi yanıt (bir hava dolu sistemi ile ilgili genişleme ve sıkıştırma önlemek için) için, mineral yağ ile doldurulması gerekir. Önce iğne yükleme şırınga sistem hiçbir hava kabarcıkları iğne ucu kadar tüm yol vardır emin olun. Sonra virüs yükü başlamadan önce iğne (1-2 mm uzunluğunda) küçük bir hava kabarcığı geri çekmek. Bu hava cebi virüs ve madeni yağ arasındaki mesafeyi korumaya yardımcı olur. Enjekte edilecek viral stoku son bir 0.08 mg / ml konsantrasyonu (virüs üretimi konusunda daha fazla bilgi için kaynak 1, 2 bakınız) polybrene içermelidir. Titresi 10 kat damlasına kadar konsantre retroviral stokları genelde bulaşıcı malzeme çoğunluğu içeren partikül madde, önemli miktarda içerir ve bu yüzden 5 olmadan filtre olamaz. Ayrıca, hazırlık bağlı olarak, viral stok parçalanmış ambalaj hücrelerin genomik DNA (özellikle doğrudur MLV / VSV pseudotyped virüs üretmek için 293 hücreleri kullanılarak,) viskoz olabilir. Virüs kısım viskoz ise, küçük bir miktarda DNAz ve stok gevşetmek için ilave edilmelidir, ya da yükleme iğne son derece zor olacaktır. A viral stok (8-10 mcL) damlacık iğne yükleme için hazırlık parafilm steril bir parçası üzerinde yer almalıdır. Daha sonra, geri çekilmesi pompa kullanarak, takunya önlemek için dikkatli bir şekilde iğne ödeme dikkat yük. Embriyoların iğne veya ultrason probu kırmak için değil dikkatli olmak yüklenen iğne, enjeksiyon alanında mikromanipülatör konuma yerleştirin. Not iğne enjeksiyon oluşmaya önce bazı nedenlerden dolayı önemli ölçüde yüklü ise enjeksiyon başlamadan önce taburcu edilebilir ucu içine küçük bir miktar hava çekmek için yararlı olabilir. Bu hava boşluğuna iğne ucu (hemen hemen her zaman bu yüklü bir iğne yararsız hale getirecek bir olay) viral stok kuruma karşı koruyabilirsiniz. Bölüm 5. Ultrason Rehberli Viral Enjeksiyon , Ultrason probu ile oluşturulan gerçek zamanlı görüntü, video monitör görüntülenmiştir ve embriyo içine mikroenjeksiyon iğne rehberlik etmek için kullanılabilir. , Bu sistemi virüsü kullanarak E8.5 amniyon kesesi içine enjekte veya E9.5-E11.5 (Figure1B) amniyotik kese veya ventriküler sistemi olabilir. Bu prosedürün en zor parçası olan ve (araştırmacı bağlı olarak 5-20 saat sipariş üzerine) usta eller deneyim önemli bir miktarda gerektirir. Ekranda parlak nokta olarak ultrason görüntüsünü iğne ucu açıktır, y ve z düzlemleri motorlu kontrollerini kullanarak prob pozisyon ayarlamaları (uygun hareket görülebilir ve x manuel kontrol düzlemi). Bu prob salınım yönü iğne uzunluğu paralel olması büyük önem taşımaktadır. Bu hareketleri sırasında embriyo içine enjeksiyon için iğne ucu konumlandırmak için görüntü düzlemi kalmasını sağlayacaktır. Embriyo, hedef bölge (Bu durumda, ön beyin ventrikül) kolayca görünür ve öyle ki yerleştirilmiş iğne rahim malzemenin en az enjeksiyon yolu ile ulaşılabilir olmalıdır. Buna ek olarak, plasenta yoluyla enjekte etmek için kritik öneme sahiptir. Hedef beyin bölgesi iğne ilerleme yönü (mikromanipülatör düğmeyi kullanarak) ile kaplı olduğu, iğne rahim duvarına dokunmadan olmalı ve daha sonra kısa bir hızlı aşısı ileri dokuya nüfuz gerekir. Benzer bir yaklaşım amnionic kese ve beyne nüfuz etmek için kullanılır. Bazı durumlarda, özellikle iğne çok keskin ve deneyimli araştırmacı, tek bir hareket ventrikül vurabilir. Mekanik, hareketli prob, iğne ve embriyolar (anne sahnede hareket ettirerek), pratik eğitim master gerektirir. İstenilen sayıda embriyo enjekte edildikten sonra, 5.0 ipek sütürler ile karın duvarına yakın. Sütür mekaniği bu tip ameliyatlar özgü değildir. Son olarak, karın kas dikiş üzerinde birlikte cilt zımba veteriner autoclips kullanmak. Fare dikiş çiğnemek, çünkü cilt dikilmesi tavsiye edilmez. Analjezi uyanır gibi fare ile ağrının miktarını azaltmak için kesi bölgesine uygulanmalıdır. % 0.25 bupivakain solüsyonu (0.8 ml / kg veya 2 mg / kg) subkutan kesi boyunca her birkaç milimetre enjekte edilmesi tavsiye edilir. Fare kurtarır ederken yavaşça temiz bir kafes içinde bir jel paketi (beslenme ve hidrasyon kolaylaştırmak için) içeren emici kağıt üzerinde hayvan yatıyordu. 37 slayt sıcak setine kafes yerleştirin ° C vücut ısısını korumak için. Uyandığı zaman, temiz bir kafesin içine fare ve jel paketi ve hayvan raf dönün. Ertesi gün bütün bunlar kürtaj gösterir herhangi bir vajinal kanama, karın kasılmaları, ve / veya genel bir sıkıntı bakmak için fareyi kontrol edin. Bu durumda, hemen fare euthanize. Bakımlı saç ve genel bir sağlıklı görünümünü cerrahi başarılı kurtarma göstermektedir. Enjekte edilen embriyoların daha fazla analiz için embryonically veya postnatal kurban edilebilir. Virüs gibi insan alkalen fosfataz (PLAP) veya GFP gibi bir muhabir gen, ifade, bir boyama pozitif viral enfeksiyon (Figure1C) alanları ortaya koyacaktır. Temsilcisi Sonuçlar Enjekte embriyolar 1-2 gün yetişkinliğe enjeksiyon yolu feda edilebilir. Virüs PLAP veya GFP gibi bir muhabir gen, ifade, o muhabir ifade viral enfekte olmuş hücreleri ve bu hücrelerin klonları tanımlamak için hizmet vermektedir. Örneğin, Şekil 1C gösterilen retroviral vektör ifade PLAP E9.5 in utero bulaşmış olan bir postnatal beyin doku bölümü. Enfekte hücreler sonra mor kümeler histokimyasal boyama olarak görünür. Viral enfekte hücreler tespit ek olarak, muhabir ifadede bir hücre morfolojisi ve pozisyonu yanı sıra, gen ekspresyonu durumunu incelemek için olanak sağlar. nt "> Şekil 1 E9.5 fare önbeyin ventriküller içine Viral enjeksiyon. A. anestezi hayvan enjeksiyon sahnede yer alır. Iki embriyo (ok) ultrason probu altında maruz kalan ve yerleştirilmiş olacaktır. Virüs dolu mikroenjeksiyon iğne embriyolar yakınında ve ultrason probu ile dizilmiş. B. Ekran E9.5 fare embriyo gerçek zamanlı ultrason görüntüsü yakalama. V, ventrikül;; UW AS, amniyon kesesi, rahim duvarına. C. Embriyolar E10.5 bir PLAP ifade virüs enjekte edildi. PLAP için histokimyasal boyama, viral enfeksiyon olayların yerini ortaya koymaktadır.
