אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5

חלק 1. הכנת שטח כירורגי אם עובדים עם חומרים כימיים ביולוגית מסוכנת (וקטורים retroviral למשל), הניתוח צריך להתבצע בתוך השנייה biosafety הממשלה (BSC). Backscatter אולטרסאונד מיקרוסקופ (UBM) צריך לשבת ליד BSC, עם מתמר בתוך BSC, והחזיק במקום על ידי תמיכה מנוע נשלט על הבמה כירורגי במיוחד. הרכיבים הדרושים כדי לבנות את הבמה המוצג בסרטון מופיעים על הקו. רשימה זו, יחד עם תמונות של השלב מכמה זוויות (על פי דרישה), צריך היתר בנייה. הפתיחה והסגירה של laparotomy (הליך כירורגי שבו חלל הבטן הוא חתך פתוח על מנת לאפשר גישה אל איברים פנימיים) מבוצעת בדרך כלל על משטח סופג בגיבוי פלסטיק. לפני הניתוח את כל הכלים הדרושים (כגון: גילוח, מספריים כירורגיות, מלקחיים, נטען autoclip applier, וכו '), חומרים (כגון PBS, תפרים, הרדמה, בעל העכבר צלחת שמעליה, וכו') צריך להיות מעוקר והושמו כירורגי באזור. הגבלת משך הזמן חתך פתוח חשוב למקסם את סיכויי ההצלחה עם הניתוח. כל טיפול בבעלי חיים צריכה להתבצע עם כפפות כי כבר לחטא עם פתרון MB-10, או שווה ערך. חיטוי חוזרות יש לבצע לפי הצורך להבטיח כי הם כפפות סטריליות. חלק 2. עכבר הרדמה ממלאים מזרק 1 סמ"ק עם פתרון ההרדמה המכיל 1 חלק נמבוטל (50 מ"ג / מ"ל ​​pentobarbital) ל -4 חלקים מסוננים מעוקרים 25 מ"ג / מגנזיום סולפט מ"ל PBS. זה יביא פתרון זה הוא 10 מ"ג / מ"ל ​​pentobarbital ו 20 מ"ג / מ"ל ​​מגנזיום סולפט. כל עכבר צריך להיות משוקלל בנפרד, הוזרקו 90 מ"ג של pentobarbital ק"ג ממשקל הגוף (למשל, עכבר 28 גרם היה להיות מוזרק עם μL 250). להזריק לתוך הבטן (IP intraperitoneal,) של עכבר בהריון ביום עובריים (E) 9.5 (אפשר להשתמש בגילאים אחרים לפי הצורך) חודר את העור גם שרירי הבטן. אפשר 8-12 דקות העכבר כדי להפוך ללא תגובה. הרדמה הולם צריכה להיות מאושרת על ידי בתנוחה נינוחה של החיה, וחוסר תנועה בתגובה הזנב צובט הבוהן. צובט בעדינות בין ציפורניים היא רגישה מאוד, וחוסר תגובה כלשהי צובט כזה עולה כי בעלי החיים הוא הרדים מספיק. הערה אפילו בעלי חיים מגיבים לחלוטין צובט הזנב הבוהן פעמים מסוימים עשויים להתעוות מעט בתגובה חתך הניתוח הראשוני. עם זאת, מדובר בתגובה רפלקסיבית ואינו מצביע הרדמה לקויה. מבוססי נפט צרי עיניים צריך להיות מוחל על העיניים של העכבר, כדי למנוע התייבשות במהלך הניתוח. הקמה באזור כירורגית מכונת אולטרסאונד בזמן ההמתנה העכבר כדי להיות בהרדמה. מאז השימוש רטרווירוס או lentivirus דורש BSL2 הבלימה, כאמור לעיל את הזריקות ויראלי צריכה להתבצע בתוך ארון biosafety השנייה. בנוסף, פתרונות כל חומרי הפנויה כי בא במגע עם הנגיף יש לחטא בתמיסת כלור בריכוז 10%. כלים כירורגיים וציוד אולטרסאונד יש להתייחס פתרון חיטוי כגון MB-10 ( http://www.quiplabs.com/mb10.htm ), או שווה ערך בשימוש במתקן המדובר. חלק 3. חשיפה של העוברים במידת האפשר (בהתאם למגבלות של המתקן חיה נתון שטח פנוי) הוא העדיף לקבל את השטח כהכנה כירורגית במיקום נפרד מאזור הניתוח. זה יהיה למזער את סיכויי זיהום צולב בין בעלי חיים. כדי ליזום את הניתוח, המקום חיה על גבו על גבי משטח סופג סטרילית לשטוף את האזור ביסודיות עם בטן אתנול 70%. טיפולים presurgical נרחב יותר יכול להיות מועסק (למשל, סיבובים רצופים של בבטאדין ושוטף אתנול 70%), אבל הניסיון שלנו זה לא הכרחי עבור סוג זה של ניתוח הישרדות מכרסמים. בעזרת סכין גילוח קצה כפול, לגלח את השיער מהבטן בשטח של כ 1 ס"מ ברוחב 1.5 סנטימטרים. השתמש בתנועות קצרות ומהירות עם סכין גילוח בזווית של כ 45 מעלות. חשוב שאזור הניתוח להיות מטופלים כראוי, אבל לא נתון הרטבה מוגזמת, מכיוון שהדבר עלול לגרום מצמרר מיותר של בעלי החיים, ואולי אפילו היפותרמיה. בעזרת מספריים כירורגיות בסדר לעשות 1 "חתך אורכי דרך העור הראשון, ולאחר מכן דרך שריר הבטן של החיה (חיתוך דרך רקמת החיבור מחזיק את העור לשריר יעזור עם החתך השני). שים לב לאורך כל ההליך צריך טיפול לנקוט כדי להבטיח את כלי הניתוח נשארים סטריליים, וטיפול בחומר חיטוי אמור להתבצע לפי הצורך (כלומר, אם עצות כלי לבוא במגע עם הלא STEלהרגיז חומר). באמצעות מלקחיים ובזהירות להוציא קרניים הרחם, ולהקליט את מספר העוברים מכל צד. תוך השארת שני עוברים סמוך חשוף (מבחר שבו שני יהיה תלוי בתצורה בכל צד), במקום רוב קרני הרחם בחזרה החיה. בהקשר זה, שני עוברים, יהיו חשופים בכל זמן נתון טובל PBS, ואילו האם נותרה על גבה. מניחים את חיה על גבו לתוך מחזיק פרספקס איפה זה יהיה במהלך הניתוח (Figure1A) *. בשלב הבא, להפחית את רקמת 10 ס"מ תרבות צלחת ** (שאמור להיות ולחטא עם MB-10 לפני השימוש) מעל האם, עם זוג מלקחיים להציב מעט דרך הממברנה silastic ירוק (נעשה באמצעות L RTV בסיס גומי סיליקון, ו ריפוי סוכן;-Dow Corning מספרי מוצרים 3142761 ו – 2156946, בהתאמה). כפי שאתם להוריד את צלחת מעל החיה, להשתמש במלקחיים לאחוז את רקמת הרחם בין שני העוברים להיות מוזרק, בעדינות למשוך אותם דרך הממברנה. במקביל, צלחת הוא הוריד לגמרי למטה, אל בעל, ואת נעצים נדחפים כדי להחזיקו במקום. טרום התחמם (עד 37 ° C) PBS הוא הוסיף אז המנה כדי לכסות לחלוטין את העוברים. מניחים את שלב ההזרקה המכיל את בעלי החיים עוברים שנחשפו תחת בדיקה אולטרסאונד (Figure1A) כדי ליצור בזמן אמת הדמיה של עוברים שנחשפו דרך דופן הרחם (Figure1B). החללית אז היא הורידה (באמצעות בקרות ממונע) לאמבטיה PBS ישירות על עוברי להיות צילמו. תמונות ניתן להשיג כאשר החללית הוא כ 2-3 מ"מ מן העוברים. חשוב מאוד לוודא כי ראש בדיקה לא פגע בעוברים כפי שהיא נעה קדימה ואחורה כדי לאסוף תמונות. * בעל האם נח במהלך הניתוח יכול בקלות להתבצע על ידי במסגריה. זה צריך לכלול בסיס פרספקס רחב, עם שני הצדדים מודבק על גבי פרספקס, מרחב ביניהם (רחב מספיק העכבר כדי להתאים בשכיבה על הגב שלה). הצדדים צריכים קרקע בעמק מהם, אשר מלא אז עם שעווה שחור (למשל ממגש דיסקציה). שעווה זה משמש החומר שלתוכו נעצים יילחצו להחזיק את הצלחת של PBS כי עוברים הם טובל במהלך ההזרקה. ** כלים 10 ס"מ חיידקי צריך חור (כ 2 ס"מ קוטר) אגרוף מתוך במרכז התחתון (זה יכול להיעשות עם Heavy Duty Punch Portable ו למות 13/16 ה מעגלי אינטש: http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). בנוסף, שני חורים קטנים בכל צד של החור במרכז (כ 1.5cm משם) צריך להיות שרוף עם מחט להבה מחומם (או שהם יכולים להיעשות עם מקדח כמובן). חורים אלה מכוסים אז עם גריז ואקום יהיה שם נעצים אשר מחזיקים את הצלחת על בעל לדחוף את השעווה לתוך השחור. גריז ואקום היא למנוע PBS ייזל החוצה. חלק 4. טוען וירוס לתוך מחט Microinjection אופנה מחט microinjection ידי beveling 1mm (קוטר פנימי) משך זכוכית נימי. החדות של המחט הוא קריטי, ועבודה עם מחט חדה מספיק יכול ברצינות פשרה חדירת דופן הרחם ואת שק amnionic, והוא יכול להוביל לכישלון הניסוי. המחט חידד ממוקם אז לתוך מחזיק פיפטה, אשר מחובר דרך צינורות אל microsyringe 25 μL רכוב משאבת עירוי / נסיגה ידנית (מכשירים אחרים יכולים לשמש כדי לווסת את העמסה ופריקה של המחט, אבל זה מה המוצג בסרטון). עבור היענות אופטימלית (כדי למנוע את התפשטות ודחיסה הקשורות למערכת האוויר מלא), microsyringe, צינורות, ואת המחט צריך להיות מלא עם שמן מינרלי. לפני טעינת מחט לוודא שאין בועות אוויר במערכת מן המזרק כל הדרך אל קצה המחט. ואז לסגת בועת אוויר קטן (1-2 מ"מ אורך) אל תוך המחט לפני תחילת לטעון וירוס. זה כיס האוויר מסייע לשמור על הפרדה בין הנגיף לבין שמן מינרלי. המניה ויראלי להיות מוזרק אמור להכיל polybrene בריכוז הסופי של 0.08 מ"ג / מ"ל ​​(לקבלת מידע נוסף על ייצור וירוס עיין הפניות 1, 2). שים לב כי מניות retroviral מרוכזים בדרך כלל מכילים כמות משמעותית של חומר חלקיקי, אשר מכיל את רוב החומר זיהומיות, ולכן לא ניתן לסנן ללא 5 – לירידה של פי 10 titer. כמו כן, תלוי בהכנה, המניות ויראלי יכול להיות צמיגה מ-DNA הגנומי של תאים אריזה lysed (נכון במיוחד אם באמצעות 293 תאים לייצר MLV / VSV וירוס pseudotyped). אם aliquot של הנגיף היא צמיגה, כמות קטנה של DNAse אני יכול וצריך להוסיף כדי לשחרר את המניות, או טעינת המחט יהיה קשה מאוד. אגל של המניה ויראלי (8-10 μL) צריך להיות ממוקם על פיסת סטרילית של parafilm לקראת העמסה מחט. לאחר מכן, באמצעות משאבת נסיגה, בזהירות לטעון את תשומת לב מחט לשלם כדי להימנע כפכפים. מניחים את המחט טעון למצב micromanipulator באזור ההזרקה, נזהרים שלא לשבור את המחט על עוברים, או בדיקה אולטרסאונד. שים לב כי אם מסיבה כלשהי את המחט נטען באופן משמעותי לפני הזריקה היא להתרחש זה יכול להיות מועיל כדי למשוך כמות קטנה של אוויר לתוך קצה, אשר יכול להיות משוחרר לפני תחילת זריקות. זה כיס אוויר יכול להגן מפני המניה ויראלי ייבוש בקצה של המחט (אירוע זה יהיה כמעט תמיד להבהיר כי מחט טעון חסר תועלת). חלק 5. אולטראסאונד הזרקת נגיפי מודרך התמונה בזמן אמת נוצר על ידי בדיקה אולטרסאונד שמוצגת על צג וידאו, וניתן להשתמש בו כדי להנחות את המחט microinjection אל העובר. שימוש זה וירוס למערכת יהיה ניתן להזריק לתוך שק מי השפיר על E8.5 או גם את שק השפיר או מערכת חדרית מ-E9.5 E11.5 (Figure1B). זהו החלק הקשה ביותר של ההליך דורש כמות משמעותית של הידיים על ניסיון להשתלט על (בסדר גודל של 5-20 שעות תלוי החוקר). קצה המחט ניכרת בתמונה כמו אולטרסאונד במקום המבריקים על המסך, יש לראות נע בהתאם התאמות של עמדת בדיקה (באמצעות הפקדים ממונע ב y z ומטוסים, ועל שליטה ידנית ב x מטוס). חשוב ביותר כי כיוון תנודה של החללית יהיה מקביל לאורך המחט. זה יהיה להבטיח כי חוד המחט נותרת במישור התמונה במהלך תנועות לתפקיד זה הזרקה לתוך העובר. העובר צריך להיות ממוקם כך באזור היעד (במקרה זה החדר forebrain) גלוי בקלות נגיש המחט עם הסכום הנמוך ביותר של חומר הרחם בנתיב ההזרקה. בנוסף, חשוב לא להזריק דרך השליה. ברגע אזור במוח היעד הוא בשורה עם הכיוון של קידום המחט (באמצעות כפתור על micromanipulator), המחט צריכה להיות רק נוגע בקיר הרחם, ולאחר מכן דקירה מהירה קצר קדימה צריכה לחדור את הרקמה. גישה דומה משמש לחדור שק amnionic ואז המוח. במקרים מסוימים, חוקר מנוסה יכול להכות את החדר בתנועה אחת, במיוחד אם המחט היא חדה מאוד. המכניקה של הנעת החללית, את המחט, ואת עוברי (על ידי הזזת אמא על הבמה), דורשים הידיים על פרקטיקה לשלוט. לאחר המספר הרצוי של עוברים כבר הזריק, לסגור את דופן הבטן עם 5.0 התפרים משי. המכניקה של תפירת אינם ספציפיים לסוג זה של ניתוח. לבסוף, השימוש autoclips וטרינרי על העור מצרך יחד על תפרים בשריר הבטן. תפירת עור אינה מומלצת מאחר העכבר יהיה ללעוס את התפרים. שיכוך כאבים צריך להיות מוחל על אזור החתך כדי להפחית את כמות הכאב שחוו העכבר כפי שהוא מתעורר. מומלץ כי פתרון Bupivacaine 0.25% להיות מוזרק (0.8 מ"ל / ק"ג או 2 מ"ג / ק"ג) תת עורי כל כמה מילימטרים לאורך באתר החתך. בעוד העכבר משחזרת בעדינות להניח את חיה על נייר סופג בכלוב נקי המכיל קופסת ג'ל (כדי להקל על האכלה הידרציה). הנח את הכלוב על סט שקופיות חם ב 37 מעלות כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. כאשר התעורר, במקום את העכבר ואת חבילת ג'ל לכלוב נקי לחזור למעמד של בעלי חיים. למחרת לבדוק את העכבר על כל דימום וגינלי, התכווצויות בבטן, ו / או מבט במצוקה הכללית, כל אלו מצביעים על הפלה. אם זה המקרה, להרדים את העכבר באופן מיידי. שיער מטופח ו מראה בריא הכולל עולה מניתוח לשחזור מוצלח. עוברים מוזרק אפשר להקריב embryonically או לאחר הלידה לניתוח נוסף. אם הנגיף מבטא גן הכתב, כגון phosphatase אלקליין האנושי (PLAP) או ה-GFP, מכתים יגלה בתחומי זיהום ויראלי חיובי (Figure1C). נציג תוצאות עוברים מוזרק אפשר להקריב 1-2 ימים זריקה לפרסם כל הדרך אל הבגרות. אם הנגיף מבטא גן הכתב, כגון PLAP או GFP, אז הביטוי הכתב משמש כדי לזהות תאים שנדבק בנגיף ו שיבוטים של תאים אלה. לדוגמה, באיור 1C הוא קטע רקמה של המוח לאחר הלידה כי היה נגוע ברחם ב E9.5 עם PLAP וקטור retroviral להביע. תאים נגועים הם דמיינו כאשכולות סגול אחרי צביעה histochemical. בנוסף לזיהוי תאים נגועים בנגיף, הביטוי העיתונאי מאפשר לבחון מורפולוגיה התא ואת המיקום, כמו גם הביטוי מעמד הגן. nt "> באיור 1. הזרקה ויראלי לתוך העכבר החדרים E9.5 forebrain. א חיה הרדים מושם על השלב ההזרקה. שני עוברי יהיה חשוף ממוצבת תחת בדיקה אולטרסאונד צוין (חץ). המחט microinjection מלא וירוס ממוקם ליד העוברים והסתדרו עם החללית אולטרסאונד. מסך ב לכידת תמונה בזמן אמת אולטרסאונד של העובר עכבר E9.5. V, החדר, AS, שק השפיר, UW, קיר הרחם. ג עוברים הוזרקו וירוס PLAP-להביע את E10.5. מכתים Histochemical עבור PLAP מגלה את מיקומו של אירועי זיהום ויראלי.