Teil 1. Bereiten Sie den OP-Bereich Wenn die Arbeit mit biologisch Reagenzien (zB retrovirale Vektoren), sollte die Operation innerhalb eines Biosafety II Gehäuse (BSC) durchgeführt werden. Die Ultraschall-Backscatter-Mikroskop (UBM) sollte neben der BSC zu sitzen, mit dem Wandler im Inneren des BSC, und in Position gehalten von einem Motor gesteuert Unterstützung auf einem speziell entwickelten chirurgischen Bühne. Die benötigten Komponenten auf die Bühne in dem Video zu sehen zu konstruieren sind on line aufgeführt. Diese Liste, zusammen mit Bildern von der Bühne aus verschiedenen Blickwinkeln (auf Anfrage), sollten die Genehmigungsauflagen Bau. Das Öffnen und Schließen der Laparotomie (Eingriff in die Bauchhöhle aufgeschnitten, um den Zugang zu den inneren Organen ermöglichen wird) ist in der Regel auf eine saugfähige Unterlage mit Kunststoffträger durchgeführt. Vor der Operation alle notwendigen Tools (zB Rasierer, chirurgische Scheren, Pinzetten, geladen autoclip Applikator, etc) und Materialien (z. B. PBS, Nahtmaterial, Narkosemittel, die Maus Halter und die darüber liegenden Platte, etc.) sollte sterilisiert werden und platziert in die OP-Bereich. Begrenzung der Höhe der Zeit wird der Schnitt offen ist für die Maximierung der Chancen auf Erfolg mit der Operation wichtig. Alle tierischen Behandlung sollte mit Handschuhen, die mit MB-10-Lösung, oder das Äquivalent wurden desinfiziert durchgeführt werden. Wiederholte Desinfektion sollte durchgeführt werden, wie benötigt wird, um sicherzustellen, dass die steril sind. Part 2. Maus Anästhesie Füllen Sie eine 1 cc Spritze mit dem Narkosemittel Lösung mit 1 Teil Nembutal (50 mg / ml Pentobarbital) auf 4 Teile gefiltert sterilisiert 25 mg / ml Magnesiumsulfat in PBS. Dies wird in einer Lösung, die 10 mg / ml Pentobarbital und 20 mg / ml Magnesiumsulfat führen. Jede Maus individuell gewichtet werden sollen, und injiziert mit 90 mg Pentobarbital pro kg Körpergewicht (zB würde ein 28 gm-Maus mit 250 ul injiziert werden). Inject in den Bauchraum (intraperitoneal, IP) einer schwangeren Maus an embryonalen Tag (E) 9.5 (können auch andere Zeiten als notwendig) eindringt sowohl die Haut und Bauchmuskeln. Lassen Sie 8-12 Minuten für die Maus, um nicht mehr reagiert. Eine adäquate Anästhesie sollte durch die entspannte Haltung des Tieres bestätigt werden, und der Mangel an Bewegung in Reaktion auf Schwanz und Zehen drückt. Gently Kneifen zwischen den Fingernägeln ist sehr empfindlich, und das Fehlen jeglicher Reaktion auf eine solche Kneifen zeigt an, dass die Tiere ausreichend betäubt ist. Beachten Sie auch Tiere, die völlig unempfänglich für Schwanz und Zehen drückt sich einige Male leicht zucken in Reaktion auf den ersten chirurgischen Eingriff. Allerdings ist dies eine reflexive Reaktion und kein Hinweis auf unzureichende Anästhesie. Petroleum-basierte Augenheilkunde Balsam sollte die Augen der Maus eingesetzt werden, um zu vermeiden Trocknung während der Operation. Set-up der OP-Bereich und dem Ultraschallgerät während des Wartens auf die Maus, um sich betäubt. Da der Einsatz von Retroviren oder Lentivirus erfordert BSL2 Eindämmung, wie oben das virale Injektionen angegeben ist, muss in einem Biosafety II Cabinet durchgeführt werden. Darüber hinaus sollten alle Lösungen und Einweg-Materialien, die in Kontakt mit dem Virus kommt mit einem 10% Bleichmittel-Lösung dekontaminiert werden. Die chirurgischen Instrumente und Ultraschallgeräten sollte mit einer sterilisierenden Lösung wie MB-10 (behandelt werden http://www.quiplabs.com/mb10.htm ) oder einen gleichwertigen, von der Anlage in Frage verwendet. Teil 3. Die Exposition der Embryonen Wenn möglich (abhängig von den Zwängen des jeweiligen Tierhaltung und verfügbarer Speicherplatz) ist es bevorzugt, die OP-Vorbereitung in einer separaten Position aus dem OP-Bereich haben. Dies minimiert die Chancen für eine Kreuzkontamination zwischen den Tieren. Zur Einleitung der Operation, statt das Tier auf seinen Rücken auf einer sterilen absorbierenden Oberfläche und waschen Sie die Bauch-Bereich gründlich mit 70% Ethanol. Weitere umfangreiche präoperative Behandlungen eingesetzt (zB aufeinander folgende Runden Betadine und 70% Ethanol gewaschen) werden, sondern in unserer Erfahrung ist dies nicht notwendig für diese Art von Nagetier Überleben Chirurgie. Mit einem Double Edge Rasierer rasieren die Haare aus dem Bauch in einem Bereich von ca. 1 cm breit und 1,5 Zentimeter lang. Verwenden Sie kurze schnelle Bewegungen mit dem Rasiermesser in etwa einem 45 ° Winkel. Es ist wichtig, dass die OP-Bereich entsprechend behandelt werden, aber nicht zu starke Benetzung ausgesetzt, da dies zu einer unnötigen Kühlung des Tieres führen kann und möglicherweise sogar Hypothermie. Mit feinen chirurgische Scheren einen 1 "Längsschnitt durch die Haut zuerst, und dann durch die Bauchmuskulatur des Tieres (Schneiden durch Bindegewebe hält die Haut auf den Muskel mit dem zweiten Schnitt-Hilfe). Beachten Sie, dass während des gesamten Verfahrens ist darauf zu unternommen, um sicherzustellen, dass die chirurgischen Instrumente steril bleiben, und die Behandlung mit Desinfektionsmittel sollte durchgeführt werden, wie benötigt werden (dh wenn die Tooltips in Kontakt mit nicht-ste kommenrile Material). Mit einer Pinzette vorsichtig herausziehen Uterushörner, und notieren Sie die Anzahl der Embryonen auf jeder Seite. Beim Verlassen zwei benachbarten Embryonen ausgesetzt (Auswahl, von denen zwei von der Konfiguration auf jeder Seite abhängen wird), legen die meisten der Uterushörner wieder in das Tier. In diesem Zusammenhang werden zwei Embryonen zu einem bestimmten Zeitpunkt ausgesetzt werden und badete in PBS, während die Mutter bleibt auf dem Rücken. Legen Sie das Tier auf seinem Rücken in die Plexiglas-Halterung, wo es während der Operation (Abbildung 1a) wird *. Als nächstes niedriger die 10cm Gewebekulturschale ** (mit MB-10 vor desinfiziert werden sollten, um zu verwenden) nach unten über die Mutter, mit einer Pinzette leicht durch die grünen Silastic Membran (unter Verwendung von L RTV-Silikon-Gummi-Unterlage und legte Härter; Dow-Corning Produkt-Nummern 3142761 und 2156946, jeweils). Wie Sie die Platte weiter unten über das Tier, verwenden Sie die Zange, um die Gebärmutter-Gewebe zwischen den beiden Embryonen injiziert werden Griff, und ziehen Sie sie durch die Membran. Zur gleichen Zeit wird die Platte ganz nach unten auf den Halter, abgesenkt und die Reißzwecken sind eingedrückt, um es in Position zu halten. Vorgewärmten (37 ° C) PBS wird dann an das Gericht hinzugefügt, um vollständig zu bedecken die Embryonen. Ort der Injektion der Bühne mit den Tier-und exponierten Embryonen unter der Ultraschallsonde (Abbildung 1a), um Echtzeit-Bildgebung des exponierten Embryonen durch die Gebärmutterwand (Abbildung 1B) zu schaffen. Die Sonde wird dann abgesenkt (mit dem motorisierten Kontrollen) in die PBS-Bad direkt über die Embryonen, die abgebildet werden. Bilder erhalten, wenn die Sonde beträgt etwa 2-3 mm entfernt von der Embryonen werden. Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass der Tastkopf nicht die Embryonen getroffen, wie sie hin und her pendelt, um Bilder zu sammeln. * Die Inhaber der Mutter ruht in während der Operation kann leicht durch eine Werkstatt vorgenommen werden. Es sollte eine breite Basis aus Plexiglas, mit zwei Plexiglas Seiten auf geklebt, und ein Raum zwischen ihnen (breit genug für die Maus, um fit im Liegen auf dem Rücken). Die Seiten sollten einen Talboden aus ihnen heraus, die dann mit schwarzem Wachs (zB von einer Dissektion Fach) gefüllt ist. Das Wachs dient als Material, in das Reißzwecken gedrückt halten Sie die Platte von PBS, dass die Embryonen in sind während der Injektion gebadet werden. ** 10cm bakterielle Gerichte sollten ein Loch (ca. 2cm Durchmesser) aus der Mitte der Unterseite (dies kann mit einem Heavy Duty Tragbare Punsch und einem 13/16 th Zoll Runddüse getan werden gestanzt: http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). Darüber hinaus sollten zwei kleine Löcher auf beiden Seiten des Loch in der Mitte (ca. 1,5 cm entfernt) mit einer Flamme erwärmt Nadel (oder sie könnten mit einem Bohrer natürlich gemacht werden) verbrannt werden. Diese Löcher werden dann mit Vakuum-Fett bedeckt werden und wo die Reißnägel, dass die Platte auf den Halter zu halten durch in den schwarzen Wachs zu drücken. Die Vakuum-Fett ist die PBS ein Auslaufen zu verhindern. Teil 4. Loading Virus in eine Mikroinjektionsnadel Mode ist ein Mikroinjektionsnadel durch Abschrägung ein 1mm (Innendurchmesser) gezogen Glaskapillare. Die Schärfe der Nadel ist von entscheidender Bedeutung, und die Arbeit mit einem unzureichend spitzen Nadel kann ernsthaft gefährden Durchdringung der Gebärmutterwand und der amnionic sac, und kann auf experimentelle Versagen führen. Der geschärfte Nadel wird dann in den Pipettenhalter, die über Schläuche zu einem 25 ul Mikrospritze in einem Handbuch Infusion / Entnahme Pumpe (andere Geräte verwendet werden, um das Be-und Entladen der Nadel zu regeln, aber dies ist das, was angebracht ist gelegt gezeigt, in dem Video). Für eine optimale Reaktionsfähigkeit (auf die Expansion und Kompression mit einer luftgefüllten System verbunden zu vermeiden), sollte der Mikroliterspritze, Schläuche, und die Nadel mit Mineralöl gefüllt werden. Vor dem Laden der Nadel stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in das System von der Spritze den ganzen Weg bis zur Spitze der Nadel. Dann ziehen wieder eine kleine Luftblase (1-2 mm lang) in die Nadel vor dem Start zur Viruslast. Dieses Luftpolster hilft bei der Erhaltung Trennung zwischen dem Virus und der Mineralölindustrie. Die virale Lager, die injiziert werden sollen Polybren bei einer Endkonzentration von 0,08 mg / ml (für weitere Informationen über Virus-Produktion finden Sie Referenzen 1, 2) enthalten. Beachten Sie, dass konzentrierte retroviralen Aktien enthalten in der Regel eine erhebliche Menge an Feinstaub, die die Mehrheit der infektiöses Material enthält, und so kann nicht ohne eine 5 gefiltert werden – bis 10-fache drop in Titer. Auch abhängig von der Zubereitung kann die virale Lager werden viskosen aus der genomischen DNA der lysierten Verpackung Zellen (vor allem bei Verwendung von 293-Zellen zu MLV / VSV pseudotypisiert Virus zu erzeugen). Wenn der Aliquot-Virus ist zähflüssig, eine kleine Menge von DNAse I kann und sollte hinzugefügt, um die Lager zu lösen, oder das Laden der Nadel wird äußerst schwierig. A Tropfen des viralen Bestand (8-10 mL) sollte auf einer sterilen Stück Parafilm in Vorbereitung Nadel Laden platziert werden. Dann, mit dem Rückzug Pumpe sorgfältig Belastung der Nadel Aufmerksamkeit auf Holzschuhen zu vermeiden. Setzen Sie den geladenen Nadel in den Mikromanipulator Position in der Einstichstelle, darauf achten, daß die Nadel auf die Embryonen oder die Ultraschallsonde zu brechen. Beachten Sie, dass wenn aus irgendeinem Grund die Nadel ist deutlich vor der Injektion erfolgen soll geladen kann es hilfreich sein, um eine kleine Menge Luft in die Spitze, die vor dem Start können die Injektionen entlassen werden zu zeichnen. Dieses Luftpolster kann gegen das virale Lager Trocknen an der Spitze der Nadel (ein Ereignis, das fast immer machen wird, die geladen Nadel nutzlos) zu schützen. Teil 5. Ultraschall Geführte Viral Injection Die Echtzeit-Bild von der Ultraschallsonde erstellt wird visualisiert auf dem Bildschirm und kann verwendet werden, um die Mikroinjektionsnadel in den Embryo Führer sein. Mit Hilfe dieses Systems Virus kann in der Fruchtblase bei E8.5 injiziert werden oder entweder die Fruchtblase oder das Ventrikelsystem von E9.5-E11.5 (Abbildung 1b). Dies ist der schwierigste Teil des Verfahrens und erfordert eine erhebliche Menge an praktischer Erfahrung zu meistern (in der Größenordnung von 5-20 Stunden, je nach der Ermittler). Die Nadelspitze ist im Ultraschallbild als die hellste Stelle auf dem Bildschirm ersichtlich und sollte gesehen bewegen in Einklang mit den Anpassungen der Sonde Position (mit dem motorisierten Kontrollen in der y-und z-Ebene, und die manuelle Steuerung in die x Ebene). Es ist sehr wichtig, dass die Schwingungsrichtung der Sonde parallel zur Länge der Nadel werden. Dies wird sicherstellen, dass die Nadelspitze in der Bildebene bleibt bei Bewegungen, um es für die Injektion in den Embryo Position. Der Embryo ist so positioniert, dass die Zielregion (in diesem Fall das Vorderhirn Ventrikel) gut sichtbar ist, und ist zugänglich für die Nadel mit dem geringsten uterine Material in der Injektion Pfad sein. Darüber hinaus ist es entscheidend, nicht durch die Plazenta zu injizieren. Sobald das Ziel Hirnregion ist mit der Richtung der Nadel Aufstieg (mit dem Knopf an der Mikromanipulator) gefüttert, sollte die Nadel nur Berührung der Gebärmutterwand, und dann eine kurze schnelle jab freuen sollte das Gewebe eindringen. Ein ähnlicher Ansatz wird verwendet, um die amnionic sac und dann das Gehirn eindringen. In einigen Fällen können erfahrene Untersucher den Ventrikel in einer Bewegung getroffen, vor allem, wenn die Nadel ist sehr scharf. Die Mechanik der Bewegung der Sonde, die Nadel und die Embryonen (durch Verschieben der Mutter auf der Bühne), erfordern praktische Übungen zu meistern. Sobald die gewünschte Anzahl von Embryonen injiziert wurde, in der Nähe der Bauchdecke mit 5,0 Seidenfäden. Die Mechanik der Naht sind nicht spezifisch für diese Art von Operation. Schließlich verwenden Veterinär autoclips zu heften die Haut zusammen über die Stiche in der Bauchmuskulatur. Naht der Haut wird nicht empfohlen, da die Maus kauen die Maschen. Analgesie sollte der Schnitt-Bereich angewendet werden, um die Stärke der Schmerzen mit der Maus, wie es weckt erfahrenen reduzieren. Es wird empfohlen, eine 0,25% Bupivacain-Lösung (0,8 ml / kg oder 2 mg / kg) injiziert werden subkutan alle paar Millimeter entlang der Inzisionsstelle. Während sich die Maus wieder sanft lag das Tier auf saugfähigem Papier in einem sauberen Käfig mit einem Gel-Packung (zur Ernährung und Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern). Setzen Sie den Käfig auf eine Folie wärmer eingestellt bei 37 ° C zu halten Körpertemperatur. Wenn geweckt, die Maus und die Gel-Packung in einen sauberen Käfig und zum Tier-Rack. Am nächsten Tag überprüfen Sie die Maus für jede vaginale Blutungen, abdominale Kontraktionen und / oder eine allgemeine Distressed-Look, die alle Abtreibung hinweisen. Wenn dies der Fall ist, euthanize die Maus sofort. Gepflegte Haare und eine insgesamt gesunde Aussehen zeigen erfolgreiche Erholung von der Operation. Die injizierten Embryonen können embryonal oder postnatal für die weitere Analyse geopfert werden. Wenn der Virus drückt ein Reporter-Gen, wie menschliche alkalische Phosphatase (PLAP) oder GFP, wird eine Färbung zeigen Bereichen positive Virusinfektion (Abbildung 1C). Repräsentative Ergebnisse Injizierten Embryonen kann geopfert 1-2 Tage nach der Injektion werden den ganzen Weg bis hin zum Erwachsenenalter. Wenn der Virus drückt ein Reporter-Gen, wie PLAP oder GFP, dann Reporter Ausdruck dient dazu, viral infizierte Zellen und Klone dieser Zellen zu identifizieren. Zum Beispiel, wie in Abbildung 1C ist ein Gewebeschnitt einer postnatalen Gehirns, die in utero an E9.5 mit einem retroviralen Vektor, PLAP infiziert war. Infizierte Zellen visualisiert werden als violette Cluster nach histochemische Färbung. Neben der Identifizierung viral infizierte Zellen erlaubt Reporterexpression man Zellmorphologie und Position, sowie Genexpression Status zu prüfen. nt "> Abbildung 1. Viral Injektion in die E9.5 Maus Vorderhirn Ventrikel. A. Die narkotisierten Tier auf die Injektion der Bühne platziert. Zwei Embryonen ausgesetzt und unter der Ultraschallsonde, wo (Pfeil) positioniert werden. Die Mikroinjektionsnadel mit Viren gefüllt ist in der Nähe des Embryos liegt und aufgereiht mit der Ultraschallsonde. B. Bildschirm eines Echtzeit-Ultraschall-Bilderfassung von einer E9.5 Maus-Embryo. V, Ventrikel, AS, Fruchtblase, UW, Uteruswand. C. Die Embryonen wurden mit einem PLAP-exprimierenden Virus bei E10.5 injiziert. Histochemische Färbung für PLAP zeigt den Standort der viralen Infektion Veranstaltungen.
