الموجات فوق الصوتية ، إذ تسترشد Microinjection في الدماغ المقدم ماوس في الرحم في E9.5

الجزء 1. تعد منطقة الجراحي إذا كان يعمل مع الكواشف biohazardous (ناقلات فيروسات مثلا) ، يجب إجراء عملية جراحية داخل مجلس الوزراء ثانيا الأحيائية (BSC). ينبغي أن تشتت ارتدادي المجهر الموجات فوق الصوتية (UBM) يجلس بجانب BSC ، مع محول داخل BSC ، والذي عقد في مكان من دعم الحركية للرقابة على المسرح جراحية المصممة خصيصا. يتم سرد العناصر اللازمة لبناء المرحلة يظهر في شريط الفيديو على الانترنت. هذه القائمة ، جنبا إلى جنب مع صور لمرحلة من زوايا عدة (حسب الطلب) ، ينبغي أن رخصة البناء. عادة ما يتم إجراء افتتاح واختتام البطن (العملية الجراحية التي قطعت تجويف البطن مفتوحة للسماح بالوصول إلى الأجهزة الداخلية) على وسادة ماصة بدعم من البلاستيك. قبل الجراحة جميع الأدوات اللازمة (مثل الحلاقة ومقصات جراحية ، ملقط ، وتحميلها autoclip مطبق ، الخ) ويجب تعقيم ، والمواد (مثل برنامج تلفزيوني ، خياطة الجروح ، والتخدير ، وصاحب لوحة الماوس والفوقية ، الخ) ووضعها في الجراحية المنطقة. الحد من مقدار الوقت الذي شق مفتوح هو أمر مهم لتعظيم فرص النجاح مع الجراحة. يجب أن يتم تنفيذ جميع التعامل مع الحيوانات مع القفازات التي تم تطهيرها MB – 10 مع الحل ، أو ما يعادلها. يجب أن يتم تنفيذ التطهير تتكرر حسب الحاجة لضمان أن تكون قفازات معقمة. الجزء 2. الماوس التخدير حقنة ملء 1 سم مكعب مع الحل مخدر يحتوي على 1 جزء Nembutal (50 ملغ / مل بنتوباربيتال) إلى 4 أجزاء المصفاة تعقيمها 25 ملغ / مل سلفات المغنيزيوم في برنامج تلفزيوني. وسوف ينتج عن هذا الحل الذي هو 10 ملغ / مل بنتوباربيتال و 20 ملغ / مل سلفات المغنيزيوم. وينبغي لكل المرجح الماوس بشكل فردي ، وحقنه مع 90 ملغ من كيلوغرام من وزن الجسم بنتوباربيتال (على سبيل المثال ، سوف يتم حقنه ماوس مع 250 جرام 28 ميكرولتر). حقن في البطن (داخل الصفاق ، والملكية الفكرية) من ماوس الحوامل في اليوم الجنينية (E) 9.5 (يمكن استخدام الأعمار الأخرى حسب الحاجة) كلا من اختراق الجلد وعضلات البطن. 8-12 دقائق للسماح الماوس لتصبح غير متجاوبة. ينبغي تأكيد التخدير الكافي من جانب استرخاء الموقف من الحيوانات ، وقلة الحركة ردا على الذيل ويقرص أخمص قدميه. معسر بلطف بين اظافر حساس للغاية ، وغياب أي رد على معسر يشير إلى أن مثل هذه الحيوانات هو تخدير بما فيه الكفاية. ملاحظة حتى الحيوانات التي لا تستجيب تماما ليقرص الذيل وأخمص القدمين في بعض الاحيان قد نشل قليلا في الرد على شق الجراحية الأولية. ومع ذلك ، هذا هو استجابة انعكاسية ولا تشير تخدير كافية. وينبغي تطبيق يعتمد على النفط ومرهم للعين للعيون من الماوس لتجنب الجفاف أثناء الجراحة. انشاء منطقة الجراحية وجهاز الموجات فوق الصوتية أثناء انتظار الماوس ليصبح تخدير. منذ أن استخدام الارتجاعي أو الفيروسة البطيئة تتطلب أن يقوم BSL2 الاحتواء ، كما سبق والحقن الفيروسية في مجلس الوزراء الثاني للسلامة الأحيائية. بالإضافة ، ينبغي تطهير كل الحلول والمواد المتاح الذي يأتي في اتصال مع الفيروس مع حل التبييض 10 ٪. ينبغي أن يعامل الأدوات الجراحية ومعدات الموجات فوق الصوتية بمحلول التعقيم مثل MB – 10 ( http://www.quiplabs.com/mb10.htm ) ، أو ما يعادل المستخدم في المرفق في السؤال. الجزء 3. تعرض الأجنة إذا كان ذلك ممكنا (تبعا للقيود للمنشأة حيوانية معينة ، والمساحة المتاحة) ويفضل أن يكون لديها مجال إعداد جراحية في مكان منفصل عن منطقة العمليات الجراحية. وهذا تقليل فرص التلوث المتبادل بين الحيوانات. للشروع في عملية جراحية ، وضع الحيوان على ظهره على سطح ماصة معقمة وغسل منطقة البطن تماما مع الايثانول 70 ٪. ويمكن استخدام العلاجات سابق للجراحة أكثر شمولا (على سبيل المثال ، جولات متتالية من Betadine ويغسل الايثانول 70 ٪) ، ولكن في تجربتنا هذه ليست ضرورية لهذا النوع من الجراحة بقاء القوارض. استخدام الحلاقة حافة مزدوجة ، حلق الشعر من البطن في منطقة ما يقرب من 1 بوصة طويلة وعريضة 1.5 بوصة. استخدام حركات سريعة قصيرة مع الحلاقة في حوالي زاوية 45 درجة. من المهم أن يعامل بشكل مناسب في منطقة العمليات الجراحية ، لكنهم لم يتعرضوا لترطيب المفرطة ، حيث أن هذا يمكن أن يؤدي إلى تقشعر لها الأبدان لا داعي لهذا الحيوان ، وربما حتى انخفاض درجة حرارة الجسم. باستخدام مقص جراحي غرامة جعل 1 "شق طولي من الجلد أولا ، ثم عن طريق عضلات البطن من الحيوان (قطع من خلال عقد النسيج الضام للجلد في العضلات سوف يساعد مع الشق الثاني). لاحظ أن في جميع أنحاء الإجراء ينبغي أن الرعاية الواجب اتخاذها لضمان ان تظل أدوات جراحية معقمة ، ويجب أن يتم تنفيذ المعاملة مع مطهر حسب الحاجة (أي إذا نصائح الأداة تأتي في اتصال مع عدم مسكغيظ المادية). ملقط باستخدام رسم بعناية قرون الرحم ، وتسجيل عدد من الأجنة في كل جانب. في حين ترك اثنين المجاورة تتعرض الأجنة (اختيار اثنان منها سوف يعتمد على التكوين على كل جانب) ، المكان الأكثر من القرون الرحم مرة أخرى في الحيوان. في هذا السياق ، سوف يكون عرضة two الأجنة في وقت معين ، واستحم في برنامج تلفزيوني ، في حين أن الأم لا تزال على ظهرها. وضع الحيوانات على ظهرها في حامل شبكي حيث سيتم خلال الجراحة (Figure1A) *. المقبل ، وانخفاض زراعة الأنسجة طبق 10cm ** (التي ينبغي تطهيرها مع MB – 10 قبل الاستخدام) بانخفاض أكثر من الأم ، مع زوج من الملقط وضعت قليلا من خلال غشاء silastic الأخضر (الذي أدلى به L RTV قاعدة المطاط سيليكون ، و علاج وكيل ؛ أرقام الناتج داو كورننغ 3142761 2156946 وعلى التوالي). كما كنت أقل لوحة أسفل على الحيوانات ، واستخدام ملقط لقبضة أنسجة الأجنة في الرحم بين اثنين يتم حقنه ، وبرفق من خلال الغشاء. في الوقت نفسه ، خفضت لوحة أسفل تماما على حامل ، ويتم دفع مسامير تثبيت الورق في ليثبت في مكانه. استعد مسبقا (إلى 37 درجة مئوية) ثم يضاف إلى طبق برنامج تلفزيوني لتغطية كامل الأجنة. مكان الحقن المرحلة التي تحتوي على أجنة الحيوانات ويتعرضون تحت التحقيق الموجات فوق الصوتية (Figure1A) لإنشاء التصوير في الوقت الحقيقي من الأجنة المعرضين من خلال جدار الرحم (Figure1B). ومن ثم خفضت لجنة التحقيق (باستخدام عناصر التحكم الميكانيكي) إلى الحمام مباشرة عبر برنامج تلفزيوني على الأجنة يمكن تصوير. ويمكن الحصول على الصور عند التحقيق حوالي 2-3 مم بعيدا عن الأجنة. من المهم جدا للتأكد من أن رئيس التحقيق لا تصل الأجنة لأنها تتأرجح جيئة وذهابا لجمع الصور. * يمكن بسهولة حامل الأم تقع في أثناء الجراحة أن تدلي بها متجر للآلات. وينبغي أن تشمل قاعدة واسعة زجاج شبكي ، مع الجانبين شبكي two صقها على أعلى ، وعلى مسافة بينهما (واسعة بما يكفي لالماوس لتناسب بينما ترقد على ظهرها). يتعين على الجانبين أن لديها أرضية الوادي للخروج منها ، والتي يتم تعبئة ثم مع الشمع الأسود (على سبيل المثال من علبة تشريح). أن يخدم الشمع كمادة الذي سيتم الضغط على مسامير تثبيت الورق باستمرار صفيحة PBS التي استحم في الأجنة خلال الحقن. ينبغي الأطباق 10cm ** البكتيرية وثقب (حوالي 2cm في القطر) لكمات من وسط القاع (ويمكن أن يتم هذا مع الثقيلة المحمولة لكمة وتموت التعميم ال 13/16 بوصة : http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن حرق اثنين من الثقوب الصغيرة على جانبي الحفرة مركز (حوالي 1.5cm بعيدا) خارجا مع إبرة ساخنة اللهب (أو يمكن أن تصنع من تدريبات طبعا). ثم يتم تغطية هذه الفتحات مع الشحوم فراغ ، وسوف يكون فيها مسامير تثبيت الورق التي تحمل لوحة على حامل من خلال دفع في الشمع الأسود. والشحوم فراغ هو لمنع تسرب من برنامج تلفزيوني. الجزء 4. تحميل الفيروسات إلى الإبرة Microinjection سحبت أزياء إبرة microinjection بواسطة تجليف a 1MM (القطر الداخلي) الزجاج الشعرية. من حدة الإبرة أمر بالغ الأهمية ، والعمل مع إبرة حادة بشكل كاف يمكن أن يضر على نحو خطير اختراق جدار الرحم والكيس سلوية ، ويمكن أن يؤدي إلى فشل التجربة. ثم يتم وضع الإبرة في شحذ حامل ماصة ، وهي متصلة عبر الأنابيب إلى microsyringe 25 ميكرولتر التي تقام في مضخة التسريب / انسحاب اليدوية (يمكن استخدام أدوات أخرى لتنظيم التحميل والتفريغ من الإبرة ، ولكن هذا هو ما يظهر في شريط الفيديو). للاستجابة المثلى (لتجنب التوسع والضغط المرتبطة مع نظام الجو العابق) ، ينبغي أن تملأ microsyringe ، وأنابيب ، والإبرة مع الزيوت المعدنية. قبل التحميل الإبرة تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام من حقنة كل الطريق إلى رأس الإبرة. التعادل ثم يعود فقاعة الهواء الصغيرة (1-2 ملم في الطول) في إبرة قبل البدء لتحميل الفيروس. هذا جيب هوائي يساعد في الحفاظ على الفصل بين الفيروس والزيوت المعدنية. وينبغي أن المخزون الفيروسية ليتم حقنه في polybrene تحتوي على تركيز النهائي من 0.08 ملغ / مل (لمزيد من المعلومات حول إنتاج فيروس يرجى الرجوع إلى المراجع 1 ، 2). علما ان مخزونات فيروس تتركز عموما تحتوي على كمية كبيرة من الجسيمات العالقة ، والتي تحتوي على غالبية المواد المعدية ، وهكذا لا يمكن أن تخرج دون 5 — إلى انخفاض بنسبة 10 أضعاف في عيار. أيضا ، وهذا يتوقف على الإعداد ، قد تكون لزجة الأسهم الفيروسية من الحمض النووي الجيني للخلايا lysed التعبئة والتغليف (ينطبق ذلك بصفة خاصة إذا كان استخدام الخلايا لتوليد 293 MLV / VSV pseudotyped الفيروس). إذا قسامة من الفيروس لزجة ، وكمية صغيرة من الدناز أستطيع ، وينبغي أن تضاف إلى تخفيف الأوراق المالية ، أو تحميل الإبرة سيكون صعبا للغاية. A ينبغي أن توضع قطرة من المخزون الفيروسي (8-10 ميكرولتر) على قطعة معقمة من parafilm استعدادا لتحميل الإبرة. ثم ، وذلك باستخدام مضخة سحب ، تحميل بعناية الانتباه لتجنب دفع إبرة السدادات. مكان الإبرة تحميلها في موقف micromanipulator في منطقة الحقن ، والحرص على عدم كسر الإبرة على الأجنة ، أو التحقيق الموجات فوق الصوتية. ملاحظة أنه إذا كان لسبب ما يتم تحميل إبرة الحقن بشكل كبير قبل أن يحدث ذلك يمكن أن تكون مفيدة لرسم كمية صغيرة من الهواء إلى الحافة ، والتي يمكن تفريغها قبل البدء في الحقن. وهذا يمكن أن جيب هوائي حماية ضد فيروسات تجفيف الأوراق المالية في رأس الإبرة (واقعة من شأنها أن تجعل دائما تقريبا أن إبرة تحميل غير مجدية). الجزء 5. الموجات فوق الصوتية حقن الفيروسية استرشادا الصورة الحقيقية لمرة وإنشاؤها بواسطة الموجات فوق الصوتية لجنة التحقيق هو تصور على شاشة الفيديو ، ويمكن استخدامها لتوجيه الإبرة microinjection في الجنين. ويمكن استخدام هذا النظام يتم حقن الفيروس في الكيس الذي يحيط بالجنين في E8.5 أو بإحدى هاتين العقوبتين الكيس الذي يحيط بالجنين أو نظام من البطين – E9.5 E11.5 (Figure1B). هذا هو الجزء الأكثر صعوبة من الإجراء ويتطلب قدرا كبيرا من الأيدي على تجربة الرئيسي (بناء على أمر من 5-20 ساعة تبعا للمحقق). رأس الإبرة هو واضح في صورة الموجات فوق الصوتية كما ألمع بقعة على الشاشة ، وينبغي أن ينظر إلى التحرك وفقا للتعديلات الموقف المسبار (باستخدام عناصر التحكم في المحركات والطائرات ذ ض ، والتحكم اليدوي في س الطائرة). من الأهمية بمكان أن اتجاه ذبذبة للمسبار تكون موازية لطول الإبرة. وهذا يؤكد أن الطرف إبرة يبقى في الطائرة أثناء حركات صورة لوضعه للحقن في الجنين. ينبغي وضع الجنين مثل أن المنطقة المستهدفة (في هذه الحالة بطين الدماغ الأمامي) مرئيا بسهولة ويمكن الوصول إلى إبرة بأقل قدر ممكن من المواد الرحم في المسار الحقن. بالإضافة إلى ذلك ، فمن الأهمية بمكان عدم حقن من خلال المشيمة. بمجرد اصطف المنطقة المستهدفة الدماغ مع التقدم في اتجاه الإبرة (باستخدام مقبض على micromanipulator) ، يجب أن تكون الإبرة مجرد لمس جدار الرحم ، ومن ثم لكمة قصيرة سريعة إلى الأمام ينبغي أن تخترق الأنسجة. ويستخدم نهج مماثل لاختراق كيس سلوي ثم الدماغ. في بعض الحالات ، يمكن للمحقق من ذوي الخبرة وضرب البطين في اقتراح واحد ، خاصة إذا كانت إبرة حادة جدا. آليات تحريك التحقيق ، إبرة ، والأجنة (عن طريق تحريك الأم على المسرح) ، يتطلب التدريب العملي على الممارسة لاتقان. بمجرد حقن العدد المرغوب فيه من الأجنة ، على مقربة من جدار البطن مع خيوط الحرير 5.0. اليات خياطة ليست محددة لهذا النوع من الجراحة. وأخيرا ، استخدام autoclips البيطرية للجلد الأساسية معا خلال غرز في عضلات البطن. خياطة الجلد غير مستحسن لأن الماوس ومضغه من الغرز. وينبغي تطبيق تسكين الى منطقة الشق لتقليل كمية الألم التي يعيشها لأنه يوقظ الماوس. فمن المستحسن أن الحل بوبيفاكايين 0.25 ٪ يتم حقنه (0.8 مل / كجم ، أو 2 ملغ / كلغ) تحت الجلد كل بضعة ملليمترات على طول شق موقع. بينما يتعافى وضع الماوس بلطف الحيوان على ورق ماص في قفص نظيفة تحتوي على حزمة الجل (لتيسير التغذية والماء). مكان القفص على مجموعة شرائح يؤدي ارتفاع درجة حرارة بلغت 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. عندما استيقظت ، ضع الماوس وحزمة الجل في قفص نظيفة والعودة إلى رف الحيوان. في اليوم التالي تحقق من الماوس لأي نزيف مهبلي ، تقلصات في البطن ، و / أو في نظرة شاملة بالأسى ، وكلها تشير إلى الإجهاض. إذا كان هذا هو الحال ، الموت ببطء الماوس على الفور. الشعر اعدادهم بشكل جيد ومظهر صحي شامل تشير إلى التعافي من عملية جراحية ناجحة. ويمكن التضحية الأجنة بعد الولادة ، أو حقنها بشكل أولي لمزيد من التحليل. اذا كان الفيروس يعبر عن الجينات المراسل ، مثل الفوسفاتاز القلوية الإنسان (PLAP) أو GFP ، سوف تكشف عن تلطيخ مجالات عدوى فيروسية الايجابية (Figure1C). ممثل النتائج ويمكن التضحية أجنة حقن حقن 1-2 أيام آخر على طول الطريق وصولا إلى مرحلة البلوغ. اذا كان الفيروس يعبر عن الجينات مراسل مثل PLAP أو GFP ، ثم التعبير مراسل يعمل على تحديد الخلايا المصابة فيروسي ويستنسخ من تلك الخلايا. على سبيل المثال ، كما هو موضح في الشكل 1C هو مقطع من نسيج المخ بعد الولادة التي كانت مصابة في الرحم في E9.5 مع PLAP ناقلات معربا عن فيروسات. الخلايا المصابة هي تصور شكل مجموعات الأرجواني بعد تلطيخ النسيجية. بالإضافة إلى التعرف على الخلايا المصابة فيروسي ، والتعبير مراسل يسمح احد لدراسة مورفولوجية الخلية والموقف ، فضلا عن حالة الجينات التعبير. NT "> الشكل 1. الحقن الفيروسية في البطينين E9.5 الدماغ المقدم الماوس. يتم وضع ألف تخدير الحيوان في مرحلة الحقن. وسوف تعرض اثنين من الأجنة وضعه في إطار التحقيق الموجات فوق الصوتية ، حيث أشارت (السهم). يقع الإبرة microinjection مليئة الفيروس بالقرب من الأجنة واصطف مع التحقيق الموجات فوق الصوتية. باء شاشة التقاط صورة بالموجات فوق الصوتية في الوقت الحقيقي من جنين فأر E9.5. الخامس ، البطين ، AS ، الكيس الذي يحيط بالجنين ؛ UW ، الرحم الجدار. تم حقن الأجنة جيم مع فيروس PLAP ، معربة في E10.5. النسيجية لتلطيخ PLAP يكشف عن مكان الأحداث العدوى الفيروسية.