Overview
Dieses Video beschreibt die Kultivierung von Brustkrebszellen neben Oberschenkelknochenexplanten, um die Proliferation und Besiedlung von Krebszellen in einem modellhaften Modellsystem für menschliches Knochengewebe zu messen.
Protocol
1. Co-Culturing Breast Cancer Cells Adjacent To Bone Fragments to Measure Breast Cell Proliferation Using BLI
- Bereiten Sie vor dem Experiment eine Suspension mit 2 x 105 Brustkrebszellen/50 l vor und bereiten Sie Knochenwachsstecker für die Immobilisierung von Knochenfragmenten in der Kultur vor. Schneiden Sie eine P200-Mikropipettespitze in 3 Stücke und verwenden Sie das schmale Ende des größten Stücks in einer "Cookie-Cutter"-Manier, um kleine (ca. 35 mg) Stück Knochenwachs zu schneiden. Verwenden Sie das breite Ende des kleinsten Stückes, um die Knochenwachsstopfen zur Lagerung in eine Petrischale zu werfen.
- Legen Sie ein Stück Knochenwachs an die 12-Uhr-Position jedes Brunnens und drücken Sie vorsichtig mit einem steril-gloved Zeigefinger nach unten.
- Pipette 50 l Zellsuspension mit 1 x 105 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in der Mitte jedes Brunnens einer 6-Well-Platte. (Alternativ können Samenzellen in einem dispergierten Muster, falls gewünscht,) Legen Sie die Platte 45 min in einen 37 °C-Gewebekultur-Inkubator, um die Zellanhaftung zu fördern.
- Legen Sie 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochenwachs für jeden Experimentierbrunnen und wenden Sie sanften Druck mit dem Rongeur an, um ihn zu sichern. Führen Sie Experimente in Dreifacharbeit durch, so dass 3 Knochenfragmente aus einer bestimmten THR-Probe in die oberen drei Brunnen gelegt werden, während die unteren drei Brunnen Knochenwachs nur als Steuerung enthalten.
- Mit einer 5 ml Pipette, sanft und langsam liefern 5 ml DMEM-10% FBS an der Seite jedes Brunnens, um zu vermeiden, die Brustzellen oder Knochenfragmente zu vertreiben. Legen Sie die Platte in einen 37 °C Gewebekultur-Inkubator für 20-24 Stunden.
- Um Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) durchzuführen, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie jedem Brunnen Luziferinsubstrat (um eine Konzentration von 300 g/ml zu erreichen) hinzu. Stellen Sie die Platte sofort auf einer IVIS Imaging Platform unter Verwendung der folgenden Parameter auf: F-Stop von 1, kleine Binning, Belichtungszeit von 1 Sek., Stufe D. Messen Sie die Signalintensität jedes Brunnens sowie die durchschnittliche Ausstrahlung (Photonen/Zweite/Quadratzentimeter/Steradian).
- Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Regionen von Interesse (ROI) zu definieren, um die durchschnittliche Ausstrahlung für alle Versuchs- und Kontrollbrunnen zu quantifizieren. Exportieren Sie durchschnittliche Strahlungswerte in ein Excel-Blatt, um Statistiken durchzuführen und Diagramme zu generieren.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/ Strep |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 |