세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

나도 셀 추적기 CMFDA과 CMRA으로 세포 중 실험 마우스 흑색증 셀 라인 (B16 – F1)의 이전 준비 세포에서 수행되었다. 세포 10% 태아 소 혈청, 0.15 MG / ML L – 글루타민, 16 MG와 보충 DMEM 문화 매체 70~80%의 합류 (Dulbecco의 수정 이글의 중간)에 두 분리된 25cm 두 문화 flasks (TPP, ZDA)에 재배 / ML gentamicin (시그마 – 알드리치, 독일에서), 200 단위 / ML crystacillin (Pliva, 크로아티아), 그리고 37 5 % CO 2에서 incubated ° C. 원래의 염료 50 μg에 10.76 μl 및 DMSO (시그마 – 알드리치, 독일) 9 μl를 (그린 CMFDA과 오렌지 CMRA 들어, 각각)을 추가하여 셀 추적기의 두 10 MM 주식 솔루션 (Invitrogen, 미국)를 준비 Invitrogen의 유리병. 주식 솔루션 ° C 몇 달 동안 4 냉장고에 저장할 수 있습니다. DMSO의 크리스탈 녹이신 때까지 실험을 시작하기 전에, 솔루션을 따뜻하게. 중탄산염 무료 크렙스 – Hepes 버퍼 (130 MM NaCl, 4.7 MM KCl, 1.2 MM MgSO 4, 1.2 MM KH 2 PO 4, 11.7 MM D – 글루코오스, 1.3 MM CaCl 2, 10 MM HEPES, pH를 7.4) 준비합니다. 두 15 ML Eppendorf 튜브는 별도로 중탄산염 무료 크렙스 – Hepes 버퍼 3 ML 각 재고 솔루션 2.1 μl (10 MM CMFDA 또는 CMRA, 각각)을 섞는다. 이것은 약 7 μm의 CMFDA (또는 CMRA)가 포함된 '로딩 솔루션 "을 산출. 중탄산염 무료 크렙스 – Hepes 버퍼와 두 세포를 씻어 후 flasks에 솔루션을 로딩 삽입합니다. 37 5% CO 2에서 30 분 동안 전지를 품어 ° C. 이 첫 번째 배양 시약은 세포 점막을 통해 자유롭게 통과하는 동안, 일단 세포 내부의 시약은 휴대 impermeant 형광 반응 제품으로 변모하고 있습니다. 37 첫번째 부화 후 씻어 5% CO 2에있는 다른 두 시간 동안 배지로 세포를 품어 ° C. 두 flasks의 세포를 Trypsinize (CMFDA 및 CMRA와 함께로드)과 50 ML의 원심 분리기 튜브의 비율 1시 1분 (TPP, ZDA)에 함께 적색과 녹색의 세포를 섞는다. DMEM 매체로 희석하거나 원심 분리기와 농도가 5 × 10 6 세포 / ML에 세포 농도를 조정합니다. 24 multiwell 플레이트 (TPP, ZDA) 각 우물에 세포 현탁액의 20 μl 드롭 놓습니다. ° C 20 분 위해 약간 우물의 표면에 부착하고 세포 연락처를 설정할 수 있도록 37 5 % CO 2 세포를 품어. II. Electrofusion (10 MM KH2PO4, 10 MM K 2 HPO 4, 1mM MgCl 2, 75 MM의 자당) isoosomolar 칼륨 인산 버퍼를 준비 (10 MM KH2PO4, 10 MM K 2 HPO 4, 1mM MgCl 2, 250 MM의 자당)과 hypoosmolar 칼륨 인산염 버퍼 . 잘 하단의 현미경 무대, 위치에 전지 전극으로 multiwell를 삽입하고 펄스 발생기에 연결합니다. isoosomolar 인산 칼륨 완충액 1 ML있는 세포를 씻으십시오. 세포 팽창을 유도하기 위해 hypoosmolar 인산 칼륨 완충액 350 μl를 추가합니다. 버퍼 전극을 커버한다. 전기 펄스를 적용하기 전에 2 분 동안 hypoosmolar 버퍼에 세포를 남겨주세요. 인테리어와 세포의 외부 사이의 삼투 불균형에 의한 세포에 물 분자의 시간 동안 유입 세포 볼륨의 증가의 원인이됩니다. 세포가 자신의 최대 볼륨을 가까이 때 전기 펄스는 규제 볼륨 감소 시작하기 전에 적용되어야합니다. 최적의 electrofusion를 달성하고 세포 생존을 유지하기 위해 전기 펄스의 최적의 매개 변수를 사용해야합니다. 이들은 [1]를 사용하여 세포주에 따라 달라집니다. 이 실험에 8 직사각형 펄스 (1 Hz에서 100 μs 기간 각)의 기차는 electroporation 장치를 (우리의 경우 Cliniporator, IGEA, 이탈리아)를 사용하여 각 샘플에 적용됩니다. 펄스는 잘 컨트롤을 제외하고, 각 우물에 전극 사이에 약 1,200 V / cm의 전기장을 만들고, 0.8 mm의 직경과 그들 사이에 5mm 거리 두 개의 병렬 PT / IR 와이어 전극에 전달됩니다. 펄스 전송 후 10 분 동안 그대로 세포를 남겨주세요. 형광 및 위상 대비 현미경을 통해 퓨전 수율을 결정합니다. III. 이미지 수집 및 융합 수율의 결정 세포는 객관적 (x20) 및 냉각 CCD 카메라 (VisiCam 1280, Visitron, 독일)이 장착된 형광 현미경 (우리의 경우에는 자이스 혈구 AxioVert 200 자이스 혈구, 독일)를 사용하여 관찰하고 있습니다. 이미지 MetaMorph 7.1.1 (분자 디바이스, 미국)에 인수 있지만, 다른 유사한 수집 소프트웨어도 사용할 수 있습니다. CMFDA는 548 nm의에서 492 nm의에서 단색 (폴리 크롬 IV, Visitron, 독일)와 CMRA와 흥분이다. CMFDA 및 CMRA의 형광은 (D605/55m, C 두 방사 535 nm의 중심 필터, 한 (HQ535/30m, CMFDA)과 510 nm의에서 다른 중심을 사용하여 획득한 것입니다MRA, 채도, 미국) 모두. 이색성 거울 (Q515LP)의 사용은 채널 크로스 이야기를하지 못했습니다. 각 잘 다섯 무작위로 선택된 분야 세 가지 이미지 (위상 콘트라스트, 빨간색과 초록색 형광) 취득. 각각의 이미지 플렛에서 3 채널 이미지를 만듭니다. 이러한 이미지의 fluorescing 세포질은 세포 점막과 함께 볼 수 있습니다. 융합 세포 따라서 쉽게 [그림 1]을 결정하실 수 있습니다. 각 3 채널 이미지의 모든 세 가지 유형의 세포 (빨강, 녹색 및 dually 형광)을 계산합니다. 각 이미지의 모든 세포의 숫자 dually 형광 세포의 수를 나누어 dually 형광 세포의 비율을 결정합니다. 퓨전 수율은 융합 세포의 절반이 감지되지 않습니다 때문에이 곱한 dually 형광 세포의 비율로 정의 (때 같은 색상 퓨즈의 세포).입니다 대표 결과 그림 1 electrofusion 후 B16F1 세포의 세 채널 현미경 이미지 :. 위상 콘트라스트, CMRA 형광 (548 nm의 여기에서)와 CMFDA 형광 (492 nm의 여기에서), 객관적인 확대 20x